CD63@ILI-01和CD81@ILI-01免疫亲和材料收集外泌体
分别称取8 mg的CD63@ILI-01或CD81@ILI-01免疫亲和材料与4 mL细胞培养上清液混合，4℃摇床振摇2 h，离心收集材料。PBS缓冲液清洗3次，加入100 μL PBS缓冲液重新混悬上述材料，加入100 μL RIPA裂解液裂解外泌体，离心后将上清液置于-80℃保存。
在外泌体形成过程中，PS在翻转酶的作用下可以从细胞膜的内层转移到外泌体膜外侧。因此，Tim4@ILI-01的免疫亲和材料可以识别外泌体表面的PS而不受其他细胞的影响。为了探究该靶点的捕获能力，将Tim4@ILI-01免疫亲和材料进一步与CD63@ILI-01或CD81@ILI-01免疫亲和材料的捕获效果进行比较。如图3-10 A所示，利用蛋白定量法检测Tim4@ILI-01、CD63@ILI-01和CD81@ILI-01的捕获效率分别为73.6±3.7%，32.2±1.4% 和30.3±2.3%。Tim4@ILI-01免疫亲和材料的捕获效率与CD63@ILI-01和CD81@ILI-01相比分别高出2.2倍和2.4倍。随后，对上述三种方法分离的外泌体蛋白进行Western blotting实验，进一步证实了基于Tim4抗体的免疫亲和材料的捕获效率最高（图3-10 B）。此外，Tim4@ILI-01免疫亲和材料的另一个显著优势在于捕获的外泌体可以在中性条件下通过加入螯合剂直接洗脱，而基于CD63抗体和CD81抗体的材料很难实现无损洗脱。
图1 比较Tim4@ILI-01、CD63@ILI-01和CD81@ILI-01三种免疫亲和材料：（A）捕获效率；（B）外泌体标记蛋白的western blotting分析
为了考察免疫亲和材料的适用性，比较了该方法对H1299细胞、MGC-803细胞和MDA-MB-231细胞捕获效果。如图所示，Tim4@ILI-01免疫亲和材料对三种细胞的捕获效率分别为86.4±2.7%、89.4±3.3%和88.5±1.5%。捕获效率非常接近，表明Tim4@ILI-01免疫亲和材料对不同类型的细胞具有普遍的适用性。
图2 比较对H1299、MGC-803和MDA-MB-231细胞外泌体捕获效率
Figure 3-11 Capturing efficiencies of exosomes for H1299, MGC-803 and MDA-MB-231 cells
与细胞蛋白质相比，外泌体蛋白质含量较低，而裂解液中较高浓度的SDS有助于外泌体蛋白的裂解，因此进一步研究了细胞裂解缓冲液中SDS的含量（0.1%、2%、4%和8%）对外泌体蛋白质提取的影响。这几种不同的裂解液从1.56 ×1010个外泌体颗粒中提取的蛋白含量分别为24.8±3.5、44.4±2.6、49.4±1.7和45.7±1.3 μg。通过Western blotting实验进一步分析特异性蛋白的表达情况，结果表明含4% SDS的裂解液提取外泌体蛋白质的效果更好。
图3 采用0.1%、2%、4%和8% SDS细胞裂解缓冲液提取的总蛋白的产率（A）；采用Western blotting分析外泌体特征蛋白（B）
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