SN/T 3538-2013中甲酸三乙胺和三氯甲烷的作用是什么？

研究表明6种甜味剂都是水溶性的[7]，本试验比较了0.1%甲酸溶液、0.08%的甲酸溶液、水3种水相提取剂。结果表明0.08%甲酸溶液优于0.1%甲酸溶液和水，由于高pH值会影响阿斯巴甜的稳定性，故加入三乙胺来调节提取剂的pH值，当三乙胺为2.5 mL，pH=4.5时阿斯巴甜的回收比较理想。

再加入5ml三氯甲烷的作用是萃取甜味剂。

HLB固相萃取柱的容量是指固相萃取柱填料的吸附量。对于以硅胶为基质的固相萃取柱，其容量一般在1~5 mg/100 mg，也就是柱容量是填料质量的1%~5%。而键合硅胶离子交换吸附剂填料的容量以meq/g表示，即每克填料的容量为X毫克当量。这类填料的容量通常在0.5~1.5 meq/g。
SPE技术基于液-固相色谱理论，采用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、分离、净化，是一种包括液相和固相物理萃取过程；也可以将其近似地看作一种简单的色谱过程。SPE是利用选择性吸附与选择性洗脱的液相色谱法分离原理。较常用的方法是使液体样品溶液通过吸附剂，保留其中被测物质，再选用适当强度溶剂冲去杂质，然后用少量溶剂迅速洗脱被测物质，从而达到快速分离净化与浓缩的目的。也可选择性吸附干扰杂质，而让被测物质流出；或同时吸附杂质和被测物质，再使用合适的溶剂选择性洗脱被测物质。

酸奶中6种合成甜味剂的测定方法

王成华，宋苏，王卉，范广宇*，孟祥龙，姚燕林

（连云港出入境检验检疫局，江苏连云港222042）

摘 要：建立液相色谱-质谱/质谱法（liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，LC-MS/MS）同时测定酸奶中安赛蜜、甜蜜素、阿斯巴甜、阿力甜、纽甜、糖精钠的分析方法。样品经甲酸-三乙胺缓冲溶液提取后，加入亚铁氰化钾和乙酸锌沉淀析出蛋白质，经HLB固相萃取小柱净化后，再通过Phenomenex XB-C18色谱柱分离，以含0.1%（体积分数）的甲酸溶液和甲醇为流动相，进行梯度洗脱，可以在3 min内完成6种人工合成甜味剂的基线分离。在ESI负离子模式下，采用多反应监测模式进行测定，在加标水平为10、25、50 μg/kg时，被测物的回收率达到70.50%～102.10%，相对标准偏差为1.56%～4.83%。该方法可用于酸奶及其他乳酸菌饮品中合成甜味剂的测定。

关键词：酸奶；液相色谱-质谱/质谱法；安赛蜜；甜蜜素；阿斯巴甜；阿力甜；纽甜；糖精钠

酸奶是以牛奶为原料，经过巴氏杀菌后再向牛奶中添加发酵剂，经发酵后，再冷却灌装的一种牛奶制品。酸奶不但保留了牛奶的所有优点，而且某些方面经加工过程还扬长避短。其主要功效为降血压，瘦身，促消化，防止便秘，成为更加适合于人类的营养保健品。为了迎合人们的口味，生产商们往往添加一种或几种甜味剂来达到酸甜的口感[3]。随着消费和认识水平的提高，甜味剂的使用情况越来越受到人们的关注[1]。其中，安赛蜜、甜蜜素、阿斯巴甜、阿力甜、纽甜、糖精钠6种合成的甜味剂更是受到添加剂行业的青睐。

关于甜味剂检测的标准，均是针对某个和某几个甜味剂的检测，主要采用气相色谱法和高效液相色谱法[4-5]。目前在食品生产加工过程中，同时使用多种甜味剂，定量检测这些甜味剂不仅是为了保证产品的质量，更重要的是保护消费者的利益。因此，建立一种能同时测定这些甜味剂的方法就显得十分重要。对于食品中多组分甜味剂的分析，不可避免会遇到以下问题：（1）由于色谱的分辨能力有限，当样品中组分过多时，色谱手段很难将所有的组分分离；（2）相邻的色谱峰，当保留时间相近时，仅靠保留时间对组分定性既不准确也不充分；（3）对于复杂基质的样品，基质的干扰仅靠紫外检测器很难进行排除。本试验采用LCMS/MS技术，利用串联质谱分离能力强，MRM定性准确、选择性和灵敏度高的特点，能在较短的时间内对多组分进行一次性的分离和鉴定，建立一种可同时测定并能够准确定性食品中多种甜味剂的方法[6]。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent1290-6490液相色谱质谱联用仪：美国Agilent公司；THZ-92A型振荡器：艾卡仪器设备有限公司；XW-80A型旋涡混合器：上海青浦沪西仪器制造厂；TDL-40C台式离心机：上海安亭仪器厂；N-EVP 112氮气吹干仪：上海秉越电子仪器有限公司；VISZPREP固相萃取装置：美国Supelco公司。甲醇（HPLC纯）：德国默克股份有限公司；三氯甲烷（氯仿）、三乙胺：南京化学试剂有限公司；甲酸、亚铁氰化钾、乙酸锌：国药集团化学试剂有限公司；Waters oasis HLB萃取柱（6 mL）：天津市天兴达科技有限公司；水为符合GB/T 6682-2008《分析实验室用水国家标准》规定的一级水。

甜蜜素、安赛蜜、阿斯巴甜、糖精钠：纯度大于95.0%，德国Dr.Ehrenstorfe标准品有限公司。阿力甜和纽甜：纯度大于95%，北京曼哈格生物科技有限公司。准确称取该标准品，用空白样品基质配制成适当浓度的混合标准工作液，使用前配制。

1.2 仪器工作条件

色谱柱：PhenomenexC18柱（50mm×2.1mm，2.6μm）；流动相：A为0.1%（体积分数，下同）甲酸，B为甲醇；流速：0.4 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：5 μL。流动相的洗脱程序见表1。

表1 流动相的洗脱程序
Table 1 The mobile phase elution program

1.3 质谱条件

离子源：ESI；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测扫描模式（MRM）。干燥气温度：290℃；干燥气流速：14 L/min；碰撞气压力：20 Pa；鞘气温度：250℃；鞘气流速：11 L/min；毛细管电压：-4 500 V。其他质谱参数见表2。

表2 6种合成甜味剂的质谱参数和保留时间
Table 2 Mass spectrum parameters and retention time 6 kinds of synthetic sweeteners

1.4 样品前处理

1.4.1 样品的提取

称取2 g酸奶样品于50 mL离心管中，加入10 mL甲酸-三乙胺缓冲溶液，涡旋混匀，超声30 min后取出，加入5 mL的10%的亚铁氰化钾和20%的乙酸锌溶液以及5 mL的三氯甲烷，涡旋混匀以3 500 r/min的速度离心5 min，取上层清夜转移至另一只50 mL的离心管中，在残渣中加入10 mL的提取液重复以上提取过程，待净化。

1.4.2 样品的萃取

依次用5 mL甲醇、5 mL水活化HLB固相萃取柱，弃淋洗液，将上清液过柱子，弃流出液。然后用5 mL水淋洗，弃去淋洗液，抽干。用9 mL的甲醇洗脱，收集洗脱液至离心管中，在35℃下氮吹浓缩至0.5 mL，并用甲醇-水（3∶7，体积比）定容至 1 mL，过 0.22 μm 有机滤膜，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。

2 结果与讨论

2.1 提取液的选择

研究表明6种甜味剂都是水溶性的[7]，本试验比较了0.1%甲酸溶液、0.08%的甲酸溶液、水3种水相提取剂。结果表明0.08%甲酸溶液优于0.1%甲酸溶液和水，由于高pH值会影响阿斯巴甜的稳定性，故加入三乙胺来调节提取剂的pH值，当三乙胺为2.5 mL，pH=4.5时阿斯巴甜的回收比较理想。

2.2 流动相条件的优化

通过对SN/T 3538-2013《出口食品中六种合成甜味剂的检测方法 液相色谱-质谱/质谱法》的检测标准进行比较[8]，先对流动相条件进行摸索，流动相水相尝试了水、0.1%乙酸铵溶液和0.1%甲酸溶液，有机相尝试了甲醇和乙腈。采用0.1%乙酸铵溶液作为水相，无论有机相是甲醇还是乙腈，甜蜜素、糖精钠、安赛蜜的质谱响应都很低，这可能是由于在负离子扫描模式下加入乙酸铵会抑制目标化合物的离子化效率，无论有机相是甲醇还是乙腈，相对于水，采用0.1%甲酸溶液可以获得更好的质谱响应和峰型效果。流动相的选择不仅要考虑对组分的洗脱能力，而且还需考虑在质谱中是否能促使目标化合物达到较高的离子化效率。因此又考察了乙腈-0.1%甲酸溶液体系和甲醇-0.1%甲酸溶液体系，相比之下，甲醇-0.1%甲酸溶液体系可以获得更好的质谱响应。

2.3 质谱检测及色谱分离条件的优化

先对6种人工合成甜味剂分别在全扫描模式下进行扫描，分别确定6种准分子离子。从6种人工合成甜味剂的分子结构看，电喷雾离子源中易失去一个氢原子而带负电荷，且负离子模式下准分子离子峰强度高于正离子模式，即负离子模式下的灵敏度高于正离子模式，因此选择电喷雾离子源负离子模式对其进行检测。6种人工合成甜味剂的总离子流图谱见图1。

图1 6种合成甜味剂标准溶液总离子图（10 μg/kg）
Fig.1 Total ion chromatogram of 6 kinds of synthetic sweeteners（10 μg/kg）

2.4 线性关系及标准曲线

以空白的酸奶样品为基质制成基质空白标准溶液，再将6种人工合成甜味剂制成相应质量浓度的系列标准溶液，以6种人工合成甜味剂的峰面积作为纵坐标，目标物的线性方程、相关系数、线性范围和检出限见表3。

表3 目标物的线性方程、相关系数、线性范围和检出限
Table 3 The target of linear equation，correlation coefficient，linear range and detection limit

2.5 精密度及回收率验证

加标浓度分别为0.10、0.25、0.50 mg/kg的回收率试验，每份样品分别测定6次，结果见表4。

从结果可知，其平均回收率在70.50%～102.10%之间，相对标准偏差（RSD）为1.56%～4.83%。

表4 6种合成甜味剂的回收率及标准偏差
Table 4 The recovery rate and standard deviation for 6 kinds of synthetic sweeteners

3 结论

本研究通过优化流动相条件、质谱和色谱条件，建立了同时测定6种合成甜味剂的液相色谱-串联质谱法。该方法不仅实现了食品中多种合成甜味剂的同时测定，提高了检测效率，同时结果准确，灵敏度高，耗时短，能够有效的避免利用液相色谱法测定对复杂基质样品出现的假阳结果。该方法能够满足SN/T 3538-2013《出口食品中六种合成甜味剂的检测方法液相色谱-质谱/质谱法》对以上6种合成甜味剂的规定使用量检测要求，为甜味剂检测提供一种高效、快捷、准确的检测方法。利用液相色谱-质谱联用技术建立多组分的甜味剂同时测定的方法将成为将来食品安全检测技术的发展方向之一。

参考文献：

[1] 刘晓霞,丁利,刘锦霞,等.高效液相色谱一串联质谱法测定食品中6种人工合成甜味剂[J].色谱,2010,28(11):1020-1025

[2] 峰恩,杨国生,谭璐,等.色谱分析法检测人工合成甜味剂研究进展[J].山东农业科学,2011(12):1205-1210

[3] 吴婕,杨柳.高效液相色谱法同时测定食品中防腐剂、甜味剂和色素[J].化学工程与装备,2010(10):910-914

[4] 谭朝勤,吴新.高效液相色谱法同时测定面包糕点中苯甲酸(钠)、山梨酸(钾)、安赛蜜、糖精钠和脱氢乙酸(钠)的含量[J].广东化工,2009(6):458-462

[5] 文君,缪红,王鲜俊,等.气相色谱法测定食品中甜蜜素[J].中国公共卫生,2003,9(19):2013-2017

[6] 柯润辉,王丽娟,安红梅,等.超高效液相色谱-串联质谱法同时测定白酒中氨基甲酸乙酯和8种甜味剂[J].食品与发酵工业,2015(12):1300-1305

[7] 马康,蒋孝雄,赵敏,等.高效液相色谱法同时测定软饮料中20种食品添加剂[J].分析化学,2012(11):1121-1124

[8]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.SN/T 3538-2013出口食品中六种合成甜味剂的检测方法液相色谱-质谱/质谱法.北京:中国质检出版社,2013:1-25

谢谢 老师 。给解惑了

请问待净化的溶液是上层水溶液还是下层的三氯甲烷？