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色谱柱耐久性（液相）

遗忘曲线

2021/08/31

液相色谱（LC）

问：如何使HPLC色谱柱的使用寿命更长？

答：您可以使用多种选择来延长色谱柱寿命。可接受的色谱柱寿命约为1,000次进样。但是，我看到色谱柱可以进行10,000次以上的进样，而性能没有任何下降。唯一的要求是合理的色谱柱维护。

问：10000针？我从来没有在一根柱子上注射过那么多。我觉得这很难相信。

答：通常，色谱柱性能下降是由于色谱柱污染所致。如果避免这种情况，则会产生良好的色谱柱寿命。

通过使用单个等度测定法几乎连续运行色谱柱来检查色谱柱寿命。所述柱是来自Waters Corporation的Symmetry C18柱。样品是药物标准品的混合物，流动相包含79％的水，20％的甲醇和1％的乙酸。我们进行了两组实验。在其中之一中，样品直接注射到色谱柱上。在第二组中，这些柱由保护柱保护。

在不使用保护柱的情况下进行的实验导致不可逆的色谱柱性能下降，注入量约为1,500至2,000。当保留时间保持恒定时，塔板数在色谱柱寿命即将结束前不久下降，背压增加，最后观察到双峰。即使使用干净的样品，没有色谱柱保护的色谱柱寿命也会受到限制。

然后，在安装了保护柱的情况下重复了相同的实验。我们使用了由与分析柱相同的填充材料制备的高性能保护柱。在这种情况下，保护柱不会改变分离，其功能仅是分析柱的扩展。因此，分析分离不受影响。

我们很快发现，最早在约800次进样后，分析柱和保护柱的结合表现出分离度的下降。当我们更换保护柱时，分离度恢复到了我们最初观察到的相同性能。为避免色谱柱性能下降，我们决定定期以低于观察到的故障率的预定进样次数更换保护柱。当我们这样做时，直到超过10,000次进样，我们才发现分离效果没有任何恶化。然后我们停止了实验。该柱仍处于良好状态。既没有观察到保留的明显变化，也没有观察到板数的实质性变化。当我们使用填充有不同粒径的色谱柱进行相同的测试时，我们也没有发现性能差异：在这些实验中，3.5μm填料的性能与5μm填料的性能相当。

这组实验清楚地表明，填充良好的色谱柱的耐用性非常出色。我们都遇到的色谱柱寿命限制不是由于色谱柱引起的，而是由其他因素引起的。其中一些因素是来自样品，进样器，泵密封件等的异物，这些异物通常会积聚在色谱柱的顶部，并导致色谱柱性能不可逆转地下降。许多人认为，过滤器将防止色谱柱的这种机械性能下降。我们在HPLC系统中使用了标准过滤器，但它们根本无法防止色谱柱变质。只有牺牲保护柱才能保留分析柱的性能。这样做的原因很简单，就是导致分析柱变质的任何因素都将保留在保护柱上，而与原因的性质无关。

我们还对加标的血清样品进行了类似的实验。在这种情况下，我们进行了简单的蛋白质沉淀以进行样品净化。与上述实验一样，定期更换保护柱可保留分析柱。在这种情况下，由于样品基质的性质和简单的样品制备程序，需要更频繁地更换保护柱。

不幸的是，无法就何时应更换保护柱给出一般性建议。它在很大程度上取决于样品和所使用的样品净化程序。对于少量杂质而言，保护柱可能是样品制备和净化程序的合理替代品。相反，血浆或牛奶样品的制备程序仍然留下了足够量的内源性物质，因此绝对需要使用保护柱。但是你知道色谱柱受到保护柱的保护，可能会降低样品制备程序的复杂性。如果保护柱的寿命少于进样100次，我会考虑采用样品净化程序或修改样品制备过程。如果保护柱为您的分析柱提供100次或更多进样保护，则每次分析的成本不到50美分。从长远来看，更换保护柱然后继续购买新的分析柱会比较便宜。

先前的所有讨论均假定该色谱柱用于单一测定或单一程序。在这种情况下，色谱柱的污染是可以预测的。如果实验室使用许多不同的HPLC程序，我总是建议为每个程序指定一个色谱柱，包括保护柱。这消除了色谱柱从一种测定到另一种测定的交叉污染，并使色谱柱的寿命可预测和可控。如果您的实验室没有任何标准检测方法，那么这是一个沉默点。即使在这种情况下，我也会将保护柱和分析柱保持在一起，直到性能下降需要更换保护柱。

问：这是一个很好的建议，但是我相信即使分析柱受到保护柱的保护，它也不会永远持续下去。

答：这确实是正确的。还有其他限制柱寿命的元素，即使使用保护柱也是如此。室温下，反相填料在pH 2和8之间非常稳定。但是，如果升高温度，尤其是在接近填料的pH极限工作时，即使使用保护柱，色谱柱寿命也可能迅速下降。从色谱柱稳定性的角度来看，最佳方法是使用中等pH。同样，缓冲离子的选择在色谱柱降解中也起着重要作用（1）。常用的磷酸盐缓冲液不是最佳选择。使用有机缓冲液（如TRIS或pH 7-8的柠檬酸盐缓冲液）可获得明显更好的结果。同样，缓冲液浓度也起作用：较低的缓冲液浓度可延长色谱柱寿命。这需要与测定的坚固性相平衡，该坚固性在较高的缓冲液浓度下会得到改善。因此，即使在压力较大的条件下，也可以实现良好的色谱柱寿命。

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