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【第十四届原创】Leica 荧光显微镜 Confocal共聚焦成像系统使用指导
Ins_56acd671
2021/11/30
北京化工大学师生团队
私聊
金相显微镜
L
eica
荧光显微镜
Confocal
共聚焦成像
系统使用指导
——李函容 学号:2
020201169
1.
拍摄样品准配
(1)
养细胞:
复苏后传代1
-2
次,细胞活力较高时使用
(2)
铺板:
细胞消化后用完全培养基稀释至
5
-10
×1
04
个/
mL,
添加在共聚焦小皿中(每孔2
mL
)
,
37
℃
24
小时培养至贴壁
(3)
准备荧光标记的样品
(4)
细胞摄取:
控制细胞密度约
60%
加
药,控制药物浓度,避免对细胞太强的杀伤作用
(5)
固定染色:
此步骤可以拿出细胞间,在外面操作完成。
?
吸走皿中的培养基;用PBS清洗2次,可以摇床摇动2-3min
?
每皿加入1mL 4%多聚甲醛,注意从边缘添加,不要冲走过多的细胞。室温下固定15min,注意固定时尽量不要移动培养基,避免摇晃影响细胞状态。
?
用PBS清洗3次,直接倒掉即可,不用摇。
?
配置DAPI溶液:1mg/mL 的原液,取10u+990u PBS,配置成10ug/mL的溶液,可以一次多配一些分装。
?
在皿中加入900uL PBS,在皿中央加入100u 10ug/mL DAPI溶液,十字交叉摇晃均匀。避光孵育15min。
?
用PBS清洗2次,加入2滴抗荧光衰减封片剂(主要成分为甘油),避光保存待检测。
(6)
检测前,吸走封片剂。
2.
观察皿的选择:
?
共聚焦皿
:中间部位是观察部位,玻璃制造,透光性较好,周围塑料。
不建议使用平时的细胞培养皿,原因:板子较厚,透光性不够
皿
是否能重复使用:做材料不需要无菌,可以重复使用;细胞成像不可重复使用
?
载破片+盖玻片组合
:细胞爬片,用指甲油封边,倒置观察(薄的一边冲下);材料也可以滴在片子上,记得一定要盖上盖玻片,
保证盖玻片洁净,记得封片。
3.
上下机流程:
?
上机:
刷卡——听到“用户上机!”——按照“1
-6
”的顺序依次打开
6
个开关,其中“6”是个钥匙,竖着表示开机——电脑用第二个用户名进入,软件“L
AS X
:
Leica
A
pplication
S
uite
X
”
?
下机
:
先关软件,再关电脑“3”——按照“6
-5-4-2-1
”顺序依次关闭——
清洁用过的镜头
——
刷卡——
听到“用户关机!”
4.
模式选择:
初始
界面:
?
选择
configuration
、machine(最常用共聚焦拍摄模式)、widefield(宽场模式—荧光显微镜-看切片)
?
其他的选项都不要动
?
确认选择后点“O
K
”,然后能听到一些启动的声音,这个时候尽量不要碰仪器
5.
观察流程:
?
先在显微镜处用肉眼观察,判断材料合成大致情况
,
②
“明场
、
荧光”
常用
。
1)
抬起显微镜镜头,放置样品
注意事项:
载物台上有个支架,支架必须保证完全嵌入,才能保证载物台是平整的,先把
小红点
的位置卡进去
;
放样品要轻缓
2)
与正常流程一致进行对焦
镜头位置调节:
先降到底部,再反方向调节,粗调-细调
肉眼观察拍摄范围:
?
明场(BF)状态
—
点击打开IL
-
Shutter(目镜观察下的光线)
?
先在
1
0
×镜头下观察,选定大范围后选用2
0
×镜头进行局部观察并
对焦
,对焦清晰后切换至荧光;
?
荧光(FLUO)状态
-
根据不同观察染料的不同选择不同的FLUO-
F
iltercubes
,DAPI选择DAPI
-
LP,罗丹明b选择RHOD
-
LP
,聚焦清晰后切换LASX软件
3)
调色板界面
设置
-(肉眼观察)
(
图
4
:
拍摄罗丹明b染液时对应的状态)
4)
载物台调节器
?
使用L
AS
X
软件拍摄
1)
首先打开激光器:顶部
con
figuration
菜单
-
左侧laser
configu
re
2)
单激光拍摄
——使用模板
顶部
S
ettings
-
选择商品化荧光染料-自动匹配通道
。材料的吸收峰放在接收波长区间的中间,左右两边拖动多接收一些,扩大接收区域。
使用DAPI染细胞核-
有DAPI模板
;使用罗丹明b
-
可以使用
倒数第二个模板
(cy
5
的下一个
)
注意:
激发波长和接受区域之间至少相隔1
0
nm,过于接近可能导致干扰产生。
例如
:
罗丹明b的激发波长为5
40
nm,则在PM
1
或PM
3
处拖动至>5
40
nm的波长范
围进行信号接受
3)
多激光拍摄
——
染料助手
4)
预览成像效果:
a)
点击选择合适的激光后,点击界面左下角“
预览
”,在界面右侧的成像区域观察
b)
调节信号强度
,显示器下方的一排操作旋钮中的左数第一个,值越高信号越强,一般荧光的是
8
00-1000
,最高1
100
,然后把鼠标移到明场的位置一点,明场的值一般在
3
00
左右
c)
操作旋钮最后一个,细调z轴位置,幅度最小,以荧光最强代表聚焦最好的指标
d)
固定
Z
轴,换激发光,拍摄多个图像
,如果某个相的信号特别弱,选中激光控制面板中绿色的那条,用键盘的“
↑
”一点点调功率,
最大不能超过5
!
5)
拍摄:调高分辨率
,保证清晰度:预览用5
12*512
,拍摄用1
024*1024——
点“
start
”——自动序列拍摄
6)
文件
生成
:
左侧菜单栏“open
project”生成文件,右边可以“show
overlay”,可以选择局部叠加-图像上右键-
“
snapshot
”-
最左侧出现保存的叠加了多个成像的文件
7)
文件保存:
一定要保存源文件!
左侧菜单栏选中文件
——save
project的一个小磁盘图像点一下——路径“
老板的名字-你的名字-日期
”例如“yuchangyuan
-
lihanrong
-20200908
”,方便查找管理(这个保存的只能用该软件打开)
8)
文件另存为(tiff
等
):
选中文件-右键-export
as
-
tiff/
jpeg/…-
找到自己的文件夹
-
菜单中可以勾选
标尺
,
是否保存
“overlay”
9)
设备关闭:
关掉软件前先关中间的激光器控制部分,全部点为“off”,再回到“configuration”界面,把激光器也全部关掉,关掉软件,关电脑,
擦镜头
(用过的都要擦,擦镜纸+乙醇),“6
-5-4-2-1
”依次关闭。
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