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山梨酸、糖精钠出现重峰情况

  • Ins_72b284fb
    2022/06/24
  • 私聊

液相色谱(LC)

  • 液相上机,山梨酸、糖精钠出现重峰情况,色谱柱也换新的了,也是新配的混标,还是有重峰情况,这到底是什么原因导致的
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  • 123

    第1楼2022/06/24

    应助达人

    1. 调整有机相比例,看看变化趋势,如果能调开,用这个方法简单
    2. 变梯度,这个最好是有经验的实验员调整调的好的话,峰型会变得很好。
    3. 调整水相pH值,这个吧,如果你分不开的色谱峰是有酸碱性的官能团会比较好。不过pH值一变,所有色谱峰的保留时间都可能变
    4. 色谱柱,你看看峰型,有没有拖尾。如果有的话换一根好点儿的柱子可能就分开了。如果峰型还好就不用折腾了。另外实在分不开,可以考虑换柱子填料。

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  • JOE HUI

    第2楼2022/06/24

    应助达人

    楼主,你的分析条件是如何的?既然柱子都换了 标物也是新配置的 那么考虑优化方法吧,方法是调整流动相的组成。

    减小流动相中有机相的比例,一般情况下,会增加保留,增加分离度。

    此外可以调整一下流动相的pH值。

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  • Methonal

    第3楼2022/06/24

    你这个混标是用水配制的还是用甲醇配制的?如果用水配制的,请往下看。
    既然色谱柱都换过了。那就用热水(85℃以上)把几个管路都排气一下,5min以上。然后把每个管路的滤头拿下来清洗一下,能超声的超声,能用酸浸泡的就浸泡,最后用纯水把滤头洗几遍,安装好。乙酸铵溶液自己重新配,看看有机相是不是甲醇。准备就绪就重新测试。

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  • wuyuzegang

    第4楼2022/06/24

    应助达人

    可以参考一下
    液相色谱法检测苯甲酸、山梨酸、糖精钠的疑难详解

    苯甲酸、山梨酸、糖精钠是衡量食品卫生质量的重要指标,苯甲酸、山梨酸的检测参照GB/T5009.29-2003,糖精钠的检测参照GB/T 5009.28-2003,即可开展实验。


    苯甲酸、山梨酸、糖精钠虽是较常见的检测项目,但是要得到一个准确可靠的结果,也存在一定的难度,许多新手常出现因对方法理解发生偏差而检测出错的事故。笔者根据自己多年该方面工作的实际经验出发,以苯甲酸、山梨酸为着重点,从样品前处理、检测仪器的选择、超标时的判断等几个易出问题的方面,进行了详细的阐述。




    2 样品前处理的注意事项



    GB/T5009.28-2003和GB/T5009.29-2003 在文字结构上有缺陷,在涉及用仪器法测定苯甲酸、山梨酸、糖精钠时,只讲述了液体样品的前处理方法,没有涉及对固体样品的前处理。



    食品样品往往含有大量的油脂、蛋白质,对提取极为不利;如处理不干净也会污染色谱柱,影响检测工作。这类样品处理的关键在于如何找到一种较理想的沉淀剂,尽量排除待测样品中的油脂、蛋白质,且不影响待测物组分的回收率。



    GB/T5009.29-2003使用5%硫酸铜溶液沉淀蛋白,对于蛋白质含量较低的食品尚可,对于豆粉、奶粉、月饼等高油脂、高蛋白样品则沉淀效果不理想。如用10%钨酸钠溶液作为沉淀剂,效果好些;如用10%亚铁氰化钾溶液和20%醋酸锌溶液则效果更理想(这是笔者目前用过最理想的沉淀剂)。



    具体操作步骤如下:



    取一定量样品,捣碎,利用四分法原理称取样品5.0 克于50ml比色管中,加水20ml,浸泡、振荡均匀,加入氢氧化钠溶液(1mol/L)1.0 ml,加入9.5mL10%亚铁氰化钾溶液, 9.50mL 20%乙酸锌溶液,定容,振荡使其充分混匀后,用滤纸初滤除去沉淀物, 初滤液过0.45μm微孔滤膜,收集滤液于样品瓶中,样品处理液和标准有溶液各进样5uL测定。



    用这种方法简单易行,接触有机试剂少,重复性和回收率都令人满意;缺点是一定要用液相色谱法检测,有一定局限。



    3 检测仪器的选择



    虽然液相色谱仪操作起来比气相色谱仪要复杂,但笔者建议如条件许可仍尽量用液相色谱法检测。原因如下:



    3.1 液相色谱法所用的样品处理方法远比气相色谱法简单,且不需使用有机试剂。尤其对于高油脂样品(如月饼)若采用碱化-排油-酸化-提取-挥干-溶解等步骤,再上气相色谱仪检测,工作量大,试剂毒性也大,且结果由于处理步骤太多而难以保证准确。



    3.2 用液相色谱法还可同时完成糖精钠项目的检测,而气相色谱法只能做苯甲酸、山梨酸的检测。



    3.3 液相色谱仪所用的紫外检测器比气相色谱仪的氢火焰检测器灵敏,可进行更低含量的检测。如用二极管阵列检测器,还可辅助定性,这更是气相色谱氢火焰检测器不可比拟的。



    4 选用气相色谱仪时的注意事项



    GB/T5009.29所用的气相色谱柱为 5%DEGS+1%磷酸固定液的60-80目 Chromosorb W AW,。这种柱有性能稳定、重复性好、保留时间稳定的优点,但同时也有稳定时间较长的缺点。



    该柱的适用的样品提取溶剂为石油醚或乙醚,如果用甲醇或乙醇,则溶剂峰拖尾效应较大,对山梨酸的测定有影响。



    如用毛细管柱,能取得更好的峰形和灵敏度,但其稳定性及特异性不如填充柱。一般可用非极性毛细管柱,0.530mm内径,10-15m长度。色谱条件可能需用程序升温。



    在气相色谱仪上的出峰次序为先出山梨酸,后出苯甲酸。


    糖精钠不能直接用气相色谱进行检测,必须衍生化后才能汽化进样。


    5 选用液相色谱仪的注意事项



    按照GB/T5009.29,流动相应为5:95的甲醇:0.02M醋酸铵溶液,但是这个比例仅是个参考值,我们在工作中应根据实际情况进行调节。



    为什么用甲醇溶液?甲醇有两个作用,(1)防腐,液相色谱柱最怕流动相长菌,尤其霉菌。甲醇可使蛋白质变性,有杀菌作用。(2)调节流动相极性,这是最重要的一点。甲醇在溶液中比例的较小变化都会使苯甲酸、山梨酸、糖精钠的保留时间发生明显的改变,因此可以通过改变流动相中甲醇含量,以调节这几个组分的出峰和分离,以得到较理想的色谱图。



    5:95是一个通用的比例,如减少甲醇含量,苯甲酸、山梨酸、糖精钠的出峰时间变慢,扩散效应增大,峰形较差,但这三组分的分离情况较好。如增加甲醇含量,苯甲酸、山梨酸、糖精钠的出峰时间提前,扩散效应较小,峰形尖锐,但这三组分的分离情况可能受影响,产生重叠。在选择条件时,只能通过实验手段,如配制3:97,4:96,5:95,6:96,7:93的流动相,综合考虑分离效果和分离时间选择最佳比例。



    不同柱的最适比例不同,举例来说,色谱科公司的液相柱最适比例为4:96,而岛津公司液相柱的最佳比例为7:93。就是同一根柱,一年前和一年后的极性也会有变化,需调节溶液配比。



    为什么使用0.02M醋酸铵溶液?加入醋酸铵是为了调节离子强度,使待测物的峰形不致于变坏。如果单独检测苯甲酸和糖精钠,加不加醋酸铵没有什么关系,都可以得到较好的峰形;但是检测山梨酸时流动相一定要加醋酸铵,否则得不到一个完整的色谱峰,峰形呈破裂状。



    醋酸铵溶液浓度不需严格控制,0.01M、0.02M、0.04M均可。



    苯甲酸、山梨酸、糖精钠在液相上的出峰次序很有特点。在流动相5:95及以下比例时,次序是苯甲酸、山梨酸、糖精钠(注意一下气相的出峰次序),逐步增大甲醇含量,苯甲酸、山梨酸的出峰时间逐步提前,而糖精钠是出峰时间迅速提前,随着甲醇比例的逐步增大(15%-30%),原先在最后出峰的糖精钠集次和前面的山梨酸、山梨酸重叠,并位于最前面,其次序变为糖精钠、苯甲酸、山梨酸。再提高甲醇浓度,次序不变。



    用高甲醇比例条件(甲醇15%以上)做出的三种标准物质色谱图峰形较好,出峰时间也较快,但做实际样品时干扰较大;因此建议尽量使用低甲醇比例条件(甲醇5%左右)。



    6 苯甲酸、山梨酸超标时的判断



    苯甲酸、山梨酸超标的样品较多,由于它们往往牵涉到一批货物是否合格,因此责任重大。由于该方法定量较准确,因此遇到超标样品时应将精力集中于定性方面。



    如同时有气相色谱仪和液相色谱仪,建议用这两种性质相差较大的仪器进行对照,如定量结果差不多,即可确认。



    如只有气相色谱仪,应利用其在填充柱保留时间稳定的特性,同时进五针标准液和五针样品液(注:峰面积应差不多,否则需对一方按比例稀释),如标准和样品液的保留时间相差时间超过1 秒,可认为不是。(如进针的技术不过关,请不要做此实验)



    如用液相色谱仪,当检测器为二极管阵列检测器时,根据保留时间和紫外吸收图结合定性,当只有紫外检测器时,改检测波长为220nm,230nm,250nm,重复进标准和样品液,由标准和样品在不同波长的峰高比值看是否吻合。



    如有微生物检测手段,可加样品于有菌培养基中,观察有无抑菌现象,如无抑菌现象则无防腐剂。


    不是很推荐用双柱法,因为有时柱极性相差不大,反而会影响最终判断。



    7 糖精钠超标时的判断



    当检测糖精钠超标时,除了采用二极管阵列检测器或波长验证,还可以利用糖精钠的荧光特性,用荧光检测器进行验证。荧光条件是激发波长为277nm,荧光波长为410nm。只有当用荧光检测器和用紫外检测器做出的定量结果相差不多,才可以判断为是。



    还有一个简单粗糙、却也行之有效的验证方法,即感官法。糖精钠是一种甜味剂,用舌头可以感觉到它的甜味,如果含量超标,一定能尝出来。





    8 标准溶液的配制贮存问题



    苯甲酸、山梨酸、糖精钠的标准溶液如用水、乙醇作基体,一般几个月后会严重降解,。如用甲醇溶解再放于冰箱冷冻层,可保持稳定一两年。因此推荐用甲醇作溶剂。



    在配制标准溶液时,初学者常犯的错误多为用甲醇溶解苯甲酸钠,用水溶解苯甲酸,晃了半天才发现怎么也不没溶解。应该用弱碱性水溶解苯甲酸钠、山梨酸钾,用甲醇溶解苯甲酸、山梨酸。




    9 苯甲酸、山梨酸的应用范围



    首先应注意到,并不是所有食品都需要加入防腐剂,只有那些富含营养物质,且需要长时间暴露于空气的才有这样的需要,否则对厂家来说会增加不必要的成本。



    酱油、酱料、咸菜、浓缩果汁等由于开封后不可能短期内吃完,月饼等需在货架上摆放,如不加防腐剂很快会发霉变质,有添加防腐剂的必要。而利乐装或易拉罐装的饮料由于很快可以食用完毕,即在细菌大量繁殖前己被消化了,因而没有添加的必要。



    苯甲酸、山梨酸如果要起到防腐的作用,含量就不能太低。如果我们检测样品时只有几个ppm的浓度,有可能是从原料中带来的或由其它添加剂转化来的,而不是厂家出于防腐目的加入的。



    苯甲酸、山梨酸也只是防腐剂中的两种。并不是所有需要加入防腐剂的食品都会添加苯甲酸、山梨酸,有可能使用防霉剂或其它种类的防腐剂,或自行规定需冷藏(如某些月饼)。因此有些食品检测不出也属正常。


    另外,我们应该比较清楚地理解苯甲酸与苯甲酸钠、山梨酸与山梨酸钾之间的关系。在食品中添加防腐剂通常以苯甲酸钠、山梨酸钾形式加入,它们不易汽化,易溶于水,但不溶于甲醇等有机试剂;而苯甲酸、山梨酸易汽化,易溶于有机试剂,但是几乎不溶于水。检测时要注意有机酸及其盐类之间的转换。

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  • 安平

    第5楼2022/06/24

    应助达人

    楼主详细说说具体的分析条件为好,有图为好。

    何为重峰,有图么?

    建议具体问题具体分析为好

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  • 检测老菜鸟

    第6楼2022/06/24

    应助达人

    液相上机,山梨酸、糖精钠出现重峰情况,色谱柱也换新的了,也是新配的混标,还是有重峰情况,这到底是什么原因导致的

    还是先上图吧,这两个国标方法没有分离的问题。所以什么方法,什么柱子,什么谱图,麻烦贴上来。一上来就说什么原因。都胡猜。

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  • hujiangtao

    第7楼2022/06/25

    应助达人

    普通液相c18柱要用25cm的,5%甲醇加20mmol乙酸铵能分开的

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  • valorb

    第8楼2022/06/25

    要么没出峰,要么溶液配的不对?

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  • 安平

    第9楼2022/06/27

    应助达人

    什么叫做重峰?有图为好。

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  • xx_dxd_xx

    第10楼2022/06/27

    主要是pH问题。买回来的乙酸铵的pH会有不同,酸性强一点,山梨酸的峰就会向后移动,所以最好每次用pH计测一下。我以前一个帖子详细讨论了pH对分离的影响。

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