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一次鱼肉粉引发的“血案”（记一次硝基呋喃能力验证未通过的经历）

冰箱冻梨

2022/10/15

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液质联用（LCMS）

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一次鱼肉粉引发的“血案”

（记一次硝基呋喃能力验证未通过的经历）

一、基本情况

1、项目名称：ACAS-PT1518 鱼肉中硝基呋喃代谢物的测定

2、实验室代码：ACAS-PT1518-019

3、检测所用方法：农业部783号公告-1-2006

4、样品编号及结果

样品编号	实验室结果(μg/kg)	Z值	评价结果
22-Q612	1.54	-2.3	可疑
22-P418	1.15	-2.5	可疑

5、实验条件

二、原因分析

我们实验室是一个比较新的获证检测机构，鄙人不才忝为色谱方向的负责人，理论和经验都尚浅，但毕竟这个标准的方法验证之前就是我带着实验室做的，本身难度不大，我们实验室做的比较多的是海水养殖鱼类，当时用的是冷冻菱鲆鱼肉，我很确定当时回收率、RSD等结果都很好，很快就形成材料了，甚至顺便验证了文献中提到的“提高温度、缩短时间”（加盐酸溶液后37℃→50℃，16h→4h）确实对结果没有影响。现场评审时评审组的老师给加标的盲样我们也做得很好。这次能力验证确实打了我一个措手不及。

此次能力验证样品将达之际因疫情原因我们遭遇了静默封控，复工后距离截止日期不足6日，而我当时在外出差，只能让实验员自己谨慎测定。加之有积压待测的委托任务，整体工作紧迫，尽管我机构的授权签字人在数据审核时对样品数据数值整体较低持怀疑态度，但因时间紧迫，未认真查找原因，且鉴于实验员后续实验的加标回收率结果良好、人员间比对数据一致，故仓促汇总并递交上报了结果。

我回到单位两周后收到了检科院的中期报告，结果如上，立刻上报要求停止相关报告的签发，幸运的是恰好没有测呋喃的任务，给与实验室一个缓冲的时间。从人、机、料、法、环、测的各个环节进行详细分析并查找原因，同时申请了该项目的测量审核。

我机构仪器是比较新的，也进行了相关维护和检测，发现并无不妥。故而换人重新测试（我也抽空做了做，惨遭打脸）、换其他厂家标准物质、检查所用试剂、使用某品牌的质控样品等，尝试查找原因，最终都未能获得合格的结果，结果仍是偏低的多，而且是4种硝基呋喃代谢物一样的低，但内标回收率都很好，且用实验室新鲜鱼肉怎么做结果怎么都对。

着实令我哭笑不得，实验室跟鱼肉粉犯冲不成？

实验员束手无策、开始摆烂，无奈之下，我开始查阅其他的标准、文献，分析总结：

1、基质匹配的影响。

GB/T 21311中使用了基质匹配标准曲线，部分文献中也是如此。按我的理解不应是这个原因导致的结果错误，因为方法中是有同位素内标的。基质对AOZ衍生物的影响难道不应该同样作用于AOZ-D4么？是这样的话，那么内标法应该会消除影响。实在是想不通。

2、提取效率的问题。

AOZ内标回收率良好，但AOZ本身不行。我也有猜测过是化合物与鱼肉粉基质结合得太好了，尝试了适当提高酸液浓度，并未取得成效。

但淡水鱼较于海水鱼可能确实存在更高脂肪含量，乙酸乙酯对于蛋白、水解产生的肽、脂肪等有着相对很好的萃取效果，或许在某种情境下干扰了分析结果。但说来惭愧，质控样应为草鱼肉粉，实验室只有之前剩下的鲤鱼，故而先凑合用用试试。

毕竟内标是后加入的，提取我设计增加了涡旋和超声，避免物理方面因素导致鱼肉粉中的AOZ提取不出来。

3、净化程度不够的问题。

大家用783号公告这个方法相比都清楚，最后定容液是很浑浊的，有时涡旋时甚至有肉眼可见浑浊的乳状或者油状物质。有文献对最终定容液使用了SPE小柱，是很多场景都比较好用的Prime HLB。但是实验室没有30 mg，1cc规格的，但是有剩下不多的500 mg 6cc的，既然它是通过型的，我改动了方法，加10 mL盐酸溶液和10 mL乙酸乙酯，直接移取分层后的2 mL乙酸乙酯上柱弃去，再移5 mL乙酸乙酯过柱吸附、接收、氮吹。

后来听说亦有用正己烷（仅听说，未查证也未实验验证）进行净化的，猜测可能类似于农业部1077号公告-1-2008测喹诺酮、磺胺的方法，对最后定容液液液分配、离心，取下层过膜上机。

新出的GB 31656.13对前处理最后的步骤也增加了一步定容完后转移至小离心管中高速离心，再过0.22 μm滤膜上机测定。但其实我们一直是按这个步骤做的，按老标准做的话，不离心过膜极其困难，UPLC色谱柱预柱着实是受不了，肉眼可见的柱压逐步上升。

三、验证实验及结果

基于以上几点，我设计了对比试验让实验室进行初步的验证，验证内容及结果如下。

质控样指定值：19.946 μg/kg，称样量：0.5±0.005 g，理论测定值应为9.973 ng/mL。

验证内容	说明	质控样结果（无超声，无过柱步骤）	质控样结果（有超声，无过柱步骤）	质控样结果（有超声，过柱净化）
单点校正 (10 ng/mL)	按标准方法制备的曲线上一点。	依旧太低	7.2~7.6	7.4~8.0 ng/mL
空白基质单点（10 ng/mL）	称取2g鲤鱼鱼肉，其他同上。	依旧太低	12.8~13.4 ng/mL	12.4~14.0 ng/mL
空白基质过柱单点（10 ng/mL）	称取2g鲤鱼空白基质基础上，增加提取后的乙酸乙酯过柱。	依旧太低	9.7~10.3 ng/mL	10.0~10.2 ng/mL

四、小结

以上结果初步可以推断：

1、对于鱼肉粉，提取步骤增加超声的步骤对于待测药物提取出来可能比较关键。但相较于标准（单指783号公告），我还增加了盐酸溶液的量和乙酸乙酯的量，引入了其他的变量，不好下最终结论。只能说提取不应按照标准中简单进行。

2、完全匹配的基质或许可以让结果更为接近指定值，我用鲤鱼显然并不能很好的定量。这个鱼肉粉我也不知道是什么鱼的，真去买鱼的话我们单位报销比较麻烦。

3、从结果上来看，似乎发生了很有趣的现象，就是尽管我用的是鲤鱼，但是制备标准曲线的样品过柱了，就能很好的起到消除基质干扰的情况，用这个曲线点去单点校正是否过柱的质控样都可以得到很好的结果。

五、反思

1、能力验证作为重要的外部质量评价确实是评价检验机构相应检验能力的重要指标。能力验证获得的满意越多，越能证明自身检测技术与能力。初建实验室通过能力验证确实能发现一些问题和不足，同时增长经验。

2、检测是一项重复性、机械性较强的工作，这与科研完全不同我也很无奈，但是实验一线人员应当具备一定的分析和思考的能力，懂得发现问题、解决问题。这次结果出现问题，就暴露我们实验室目前的人员缺乏经验、不善于思考，不懂得去找类似标准、文献或者网上其他老师的经验总结等研读与理解，去尝试解决面对的问题。但或许这一般是常规院校硕士期间才能获取的一项重要技能了，本科期间可能比较难，或许好学校的或者一些尖子生也能养成吧。

3、时间紧迫验证实验做完后立刻就做了测量审核的样品，差不多3、4天后问了一下，得知结果没问题，等结果单就行了。为了赶进度，其实实验设计中还是有很多漏洞的，但是处于实际考虑只能越快越好。所以也很难得出最终的结论，只能做一些简单的分析和推测，也是一个遗憾。

目前封控在家我也无所事事，把这段经历和感想写出来与君共勉。