仪器信息网APP

选仪器、听讲座、看资讯

立即体验

当前位置：仪器社区 >质谱 > 气质联用（GCMS） > 帖子详情

质谱技术在蛋白组研究中的应用（二）

检测人王大锤

2023/07/14

气质联用（GCMS）

6 质谱仪的最新进展

用质谱检测蛋白，首先考虑到用PMF与 MALDI-TOF联用，如果无法检测，下一步就用ESI-MS/MS创建序列标签。在PMF分析中，MALDI的平板中只需一小部分样本就足以检测，剩下的样本就可以用来创建序列标签。并且，在MALDI-TOF仪器上，用一种叫做“源后延迟”的方法可以对只有部分序列的肽段进行检测。然而，用这个方法产生的质谱图比较难说明，精确性也很差。最近，用MALDI联合四级杆-时间质谱分析器[30，31]以及原始的MALDI-TOF/TOF[32]方法产生了。因此同一份标本可以首先考虑用PMF检测蛋白[33]，如果有必要的话，再用MS/MS创建序列标签。MALDI联合四级杆-TOF检测高通量蛋白是有希望的[31]。

7 蛋白质组研究中的转录后修饰分析

蛋白组分析很重要的一点就是能对蛋白表达水平以及转录后修饰，如磷酸化和糖基化进行研究。蛋白质的磷酸化是很有趣的，因为在信号转导途径中它扮演了重要的角色。

最早检测蛋白质表达水平的方法是进行2-DE之前用35S-Met对样本进行代谢性标记，再在2-DE上进行放射自显影[34-36]。在凝胶中，不同蛋白的磷酸化和糖基化位点通常在凝胶中显示一连串蛋白质点，但是还需要做更详细的分析来确定修饰类型。蛋白质磷酸化的改变既可以用32P标记细胞，也可以用特异性磷酸化抗体做western blotting进行研究。如果用32P标记的方法，仍然需要做2-DE。经过凝胶比较后，把感兴趣的点从胶上切下来，然后用质谱鉴定[36]。Soskic使用的是印迹法，两个2-DE同时进行，一个用于做特异的磷酸化抗体实验，另一个做常规染色。蛋白质磷酸化和糖基化更为详细的特性可以用质谱来检测，但是需要更多的起始材料而不仅仅是二维凝胶上的一个点。另外这些分析不能产生直接的序列信息，技术上也比用质谱检测蛋白要难的多。在蛋白上查找磷酸化位点有很多种方法。为了检测消化后的混和肽中哪一个是磷酸化的，可以用MALDI-MS在磷酸化前后对混合肽做PMF分析：经过磷酸酯酶处理后，磷酸化的肽将会失去一个磷酸基团，分子量将比处理前小80Da.

糖基化研究中，多聚糖从蛋白中释放出来，对多聚糖结构的检测就是从这些游离的多聚糖中得到的。一般把MALDI仪和外源性糖苷酶[37-40]联合使用进行检测。如果需要更为详细的信息，可以用ESI-MS联合使用前体离子扫描仪[41-44]。到目前为止，能够用电泳分离后的蛋白进行糖蛋白结构检测的报道很少。其中有一项研究是N端糖蛋白酶切以后用一维SDS-PAGE分离，然后用MALDI-MS以及外源性的糖苷酶进行结构分析[45]。

8 用质谱研究蛋白-蛋白之间的作用

经典的蛋白组学着重于研究蛋白质在何时何处表达。因为大部分的细胞功能都是由蛋白质复合体而不是由单个蛋白来执行的，所以鉴定蛋白质的成分和相互作用是非常重要的。这个过程可以用生物化学方法纯化蛋白质后用质谱来鉴定不同的成分，如人类剪接体的成分，酵母的核孔复合体[46]以及核蛋白体等都可以用此策略检测出来。

一般的蛋白复合体是用亲和层析的方法纯化和分离，如免疫沉淀反应[47，48]。 DNA结合蛋白可以用同它们有特异性亲和力的核酸来分离，然后用质谱来鉴定[49]。Rigaut等人在串联层析的基础上，建立了一种通用的蛋白质复合体纯化方法[50]。在这个方法中，一种TAP标签和靶蛋白融合在一起，然后把蛋白转移到宿主细胞或者组织中，融合蛋白在宿主细胞和组织中能持续表达。TAP标签包括一种A蛋白和一种钙调蛋白，在标签之间有一个TEV蛋白酶切位点。用串联亲和层析法能将融合蛋白及与它相互作用的蛋白成分从细胞提取物中有效的分离，纯化出来。Rappsiber等人分别用亲和层析，交叉耦合以及质谱等方法[51]对酵母的核孔复合物Nup85p的亲和性进行研究。经过层析以后，用一维SDS-PAGE方法就可以分离蛋白复合体中的各个成分，因此二维电泳的不足之处就可以避免。同样也有可能直接用LC-MS方法分析大分子量蛋白质复合体[52]。

蛋白组分析的优越之处主要是用于蛋白和蛋白之间的相互作用以及蛋白的转录后修饰的研究，同时也可以用于基因表达水平的研究。质谱对于蛋白组分析来说是一项非常重要的技术，近年来仪器以及数据库软件的发展使得质谱成为能力更强大的工具。

参考文献

[1] O’Farrell PH. J Biol Chem,1975,250:4007–4021.

[2] Karas M, Bachmann D, Bahr U, et al. Int J MassSpecrom Ion Process,1987,78:53–68.

[3] Meng CK, Mann M, Fenn JB. et al. Atoms, Mol Clusters,1988,10:361–368.

[4] Fenn JB, Mann M, Meng CK, et al.Science,1989,6(246):64–71.

[5] Corthals GL, Wasinger VC, Hochstrasser DF, et al.Electrophoresis,2000,21:1104–1115.

[6] Celis JE, Kruhoffer M, Gromova I, et al. FEBS Lett,2000,480:2–16.

[7] Anderson L, Seilhamer J. Electrophoresis,1997,18:533–537.

[8] Gygi SP, Rochon Y, Franza BR, et al. Mol Cell Biol,1999,19:1720–1730.

[9] Henzel WJ, Stults JT, Wong SC, et al. ProcNatl Acad Sci USA,1993,90:5011–5015.

[10] Mann M, Hojrup P, Roeppstorff P. Biol Mass Spectrom,1993,22:338–345.

[11] Pappin DJ, Hojrup P, Bleasby AJ. Curr Biol,1993,3:327–332.

[12] James P, Quadroni M, Carafoli E, et al. Biochem BiophysRes Commun,1993,195:58–64.

[13] Yates JRD, Speicher S, Griffin PR, et al. AnalBiochem,1993,214:397–408.

[14] Mann M, Wilm M. Anal Chem,1994,66:4390–4399.

[15] Eng JK, McCormack AL, Yates JR. J Am Soc Mass Spectrom,1994,5:976–989.

[16] Wilm M, Mann M. Int J Mass Spectrom Ion Process,1994,136:167–180.

[17] Wilm M, Shevchenko A, Houthaeve T, et al. Nature 1996;379:466–469.

[18] Wilm M, Mann M. Anal Chem,1996,68:1–8.

[19] Morris HR, Paxton T, Panico M, et al. JProtein Chem,1997,16:469–479.

[20] Rosenfeld J, Capedeville J, Guillemot JC, et al. AnalBiochem,1992,203:173–179.

[21] Shevchenko A, Wilm M, Mann M. Anal Chem,1996,68:850–858.

[22] Pandey A, Andersen JS, Mann M. Science’s STKE: www.stke.org/cgi/content/full/OC–sigtrans;2000/37/pl1.

[23] Kussmann M, Nordhoff E, Rahbek-Nielsen H, et al. J Mass Spectrom,1997,32:593–601.

[24] Gobom J, Nordhoff E, Mirgorodskaya E, et al. J Mass Spectrom,1999,34:105–116.

[25] Clauser KR, Baker P, Burlingame AL. Anal Chem,1999,71:2871–2882.

[26] Binz PA, Muller M, Walther D, et al. Anal Chem,1999,71:4981–4988.

[27] Bienvenut WV, Sanchez JC, Karmime A, et al. Anal Chem,1999,71:4800–4807.

[28] Neubauer G, King A, Rappsilber J, et al. Nat Genet,1998,20:46–50.

[29] Yates III JR, Carmack E, Hays L, et al. MethodsMol Biol,1999,112:553–569.

[30] Loboda AV, Krutchinsky AN, Bromirski M, et al. Rapid Commun Mass Spectrom,2000,14:1047–1057.

[31] Shevchenko A, Loboda A, Schevchenko A, et al. Anal Chem,2000,72:2132–2141.

[32] Medzihradszky KF, Campbell JM, Baldwin MA, et al. Anal Chem 2000,72:552–558.

[33] Krutchinsky AN, Zhang W, Chait BT. J Am Soc Mass Spectrom,2000,11:493–504.

[34] Nyman TA, Matikainen S, Sareneva T, et al. Eur J Biochem 2000;267:4011–4019.

[35] Celis JE, editor. Cell Biology: A Laboratory Handbook, vol. 4,2nd. Academic Press, 1998,375–385.

[36] Gerner C, Frohwein U, Gotzmann J, et al. J Biol Chem,2000,Sep 7 [epubahead of print].

[37] Colangelo J, Orlando R. Anal Chem,1999,71:1479–1482.

[38] Geyer H, Schmitt S, Wuhrer M, et al. Anal Chem1999;71:476–482.

[39] Harvey DJ. Mass Spectrom Rev,1999,18:349–450.

[40] Nyman TA, Kalkkinen N, et al. Eur J Biochem,1998,253:485–493.

[41] Sheeley DM, Reinhold VN. Anal Chem,1998,70:3053–3059.

[42] Reinhold VN, Reinhold BB, Costello CE. Anal Chem,1995,67:1772–1784.

[43] Kuster B, Hunter AP, Wheeler SF, et al. Electrophoresis,1998,19:1950–1959.

[44] Rout MP, Aitchison JD, Suprapto A, et al. J Cell Biol,2000,148:635–651.

[45] Yamaguchi K, Subramanian AR. J Biol Chem ,2000,275:28 466–28 482.

[46] Yamaguchi K, von Knoblauch K, Subramanian AR. J BiolChem,2000,275:28 455–28 465.

[47] Rotheneder H, Geymayer S, Haidweger E. J Mol Biol,1999,293:1005–1015.

[48] Boehning D, Joseph SK. EMBO J,2000,19:5450–5459.

[49] Nordhoff E, Krogsdam AM, Jorgensen HF, et al. Nat Biotechnol,1999,17:884–888.

[50] Rigaut G, Shevchenko A, Rutz B, et al. Nat Biotechnol,1999,17:1030–1032.

[51] Rappsilber J, Siniossoglou S, Hurt EC, et al. Anal Chem2000;72:267–275.

[52] Link AJ, Eng J, Schieltz DM, et al. Nat Biotechnol,1999,17:676–682.

T.A. Nyman /Biomolecular Engineering, 2001:18 .221–227.

相关话题

近期热榜

热门活动

猜你喜欢最新推荐热门推荐更多推荐

品牌合作伙伴

日立科学仪器

珀金埃尔默仪器（上海）有限公司（PerkinElmer）

珀金埃尔默仪器（上海）有限公司（PerkinElmer）

日本电子株式会社

赛默飞世尔科技

马尔文帕纳科

上海仪电科仪

梅特勒托利多

布鲁克核磁

举报帖子

点赞用户

好友列表

加载中...

正在为您切换请稍后...