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生物实验中的基础操作—病毒转染及Q-PCR

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2023/10/08
小矮马

生物实验中的基础操作—病毒转染及Q-PCR

低表达细胞模型的构建

1. 从-80°C冰箱取出慢病毒载体冰上融化，将慢病毒用空白培养基稀释为滴度2×10⁸，充分混匀，准备好病毒感染增强液。

2. 将悬浮细胞移入15 mL离心管中，900 rpm，离心8 min，弃去上清，用空白培养基重悬细胞沉淀，并用移液枪充分吹打混匀。取其中500 μL放入细胞计数仪中计数，取出1.5×10⁶个细胞置入新的离心管中。

3. 12孔板中以MOI=15的病毒滴度进行感染，培养16 h。

4. 16 h后，在原培养基中加入2 ml 新鲜完全培养基继续培养，72 h后观察荧光。

5. 细胞生长至状态良好，加入2 μg/mL嘌呤霉素筛选至90%以上细胞产生荧光。

荧光实时定量 PCR（q-PCR）

1. 总RNA的提取：分别将细胞离心，PBS缓冲液清洗2次，900 r/min 离心8 min，得到细胞沉淀。分别加入1 mL Trizol，用移液枪吸打至细胞完全破裂，加入200 μL氯仿，震荡30 s，室温静置10 min，以有效分离无机相和有机相，随后4 °C，12000 g/min 离心15 min。将上清移至高压过的1.5 mL离心管中，加入与上清等体积的异丙醇，轻柔颠倒震荡数次，室温静置10 min，随后4 °C，12000 g/min 离心10 min。弃去上清，加入75%无水乙醇，4 °C，12000 g/min 离心5 min。弃去上清，沉淀置于冰上自然干燥，

但不可完全干燥。用 30 μL DEPC水溶解总RNA。用NanoDrop One超微量分光光度计进行定量和纯度检测。

2. cDNA 的合成：将混合液轻柔吹打混匀，42 °C，2 min。

表逆转录体系
试剂名称
使用量
RNase-free ddH₂O
to 16 μL
4*gDNA wiper Mix
4 μL
模板 RNA
Total RNA：1pg-1 μg
5*HiScript III qRT SuperMix
4 μL
第一步的反应液
16 μL

3. q-PCR 检测 mRNA 的表达

GAPDH 引物序列：

Forward primer:5’-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3’

Reverse primer:5’-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’

ODC1 引物序列：

Forward primer: 5′-ATTAAAGGAACAGACGGGCTC-3′

Reverse primer:5′-ATGTGCGTGGTCATAGAGTATG-3′

q-PCR 反应体系：

表q-PCR反应体系
试剂名称
使用量
2*ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix
10 μL
Primer1（10μM）
0.4 μL
Primer2（10μM）
0.4 μL
Template DNA/cDNA
X μL
ddH₂O
To 20 μL

将混合液轻柔吹打混匀，37 °C, 15 min，85 °C, 5 s，得到cDNA

表q-PCR反应程序
反应步骤
反应温度
反应时间
循环次数
预变性
95 °C
10 min
1
变性
95 °C
10 s

退火
55-65 °C
10 s
30
延伸
72 °C
30 s

用Graphpad prism5 计算mRNA 水平的表达量。

附件：

2-3生物实验中的基础操作—病毒转染及Q-PCR .docx

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