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孔雀石绿及其代谢物残留量的测定方法验证记录

明镜历史

2023/10/18

私聊

液质联用（LCMS）

孔雀石绿及其代谢物残留量的测定

摘要：建立了水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿的测定方法。采用中性氧化铝固相萃取小柱对鲤鱼样品进行净化，Shim-pack Scepter C18 色谱柱进行分离，岛津 LCMS-8050 串联质谱检测分析，内标法定量。对空白样品 0.5μg/kg 、1μg/kg、5μg/kg三个水平浓度加标后，按照上述前处理方法处理后上机，平行6份样品考察回收率和精密度RSD，结果显示：①孔雀石绿：0.5μg/kg 加标浓度的加标回收率为84.1%-92.0%，RSD为3.6%；1μg/kg加标浓度的加标回收率为95.0%-104.2%，RSD为3.9%；5μg/kg 加标浓度的加标回收率为 103.0%-106.6%，RSD为 2.7%；②隐色孔雀石绿：0.5μg/kg 加标浓度的加标回收率为78.8%-113.2%，RSD为13.8%；1μg/kg加标浓度的加标回收率为78.8%-89.1%，RSD为5.4%；5μg/kg加标浓度的加标回收率为72.4%-84.0%，RSD为5.0%；该方法回收率高，重现性好，适用于水产品中孔雀石绿及其代谢物的测定。

1. 实验部分

1.1 实验仪器及耗材

仪器配置：Shimadzu LC-30A 与 LCMS-8050 联用系统；

色谱柱：Shim-pack Scepter C18，50×2.1 mm，1.9μm；

固相萃取小柱：中性氧化铝柱 1g/6mL；

1.2 分析条件

UHPLC 条件

色谱柱：Shim-pack Scepter C18，50×2.1 mm，1.9μm

流速：0.4 mL/min

进样量：5μL

柱温：40 ℃

流动相： A：0.1%甲酸水 B：乙腈

梯度洗脱程序如下：

时间(min)	0	2.5	3.2	3.21	4.5
A(%)	60	0	0	60	60
B(%)	40	100	100	40	40

质谱条件

离子化模式：ESI，正离子扫描扫描模式：多反应监测(MRM)

碰撞气：氩气加热气：氮气 10 L/min

雾化气：氮气 3 L/min 干燥气：氮气 10 L/min

接口温度： 300℃ DL 温度：250 ℃

加热模块温度：400 ℃

化合物参数见下表：

名称	前体离子	产物离子	Q1 Pre Bias(V)	CE(V)	Q1 Pre Bias(V)
孔雀石绿	329.20	313.10^*	-12.0	-36.0	-23.0
孔雀石绿	329.20	208.10	-12.0	-37.0	-23.0
隐色孔雀石绿	331.20	239.10^*	-12.0	-31.0	-17.0
隐色孔雀石绿	331.20	316.10	-12.0	-21.0	-23.0
隐色孔雀石绿-D6	337.20	240.10	-12.0	-33.0	-17.0
孔雀石绿-D5	334.10	318.10	-16.0	-40.0	-23.0

*定量离子对

1.3 样品前处理

1.3.1 样品提取

称取5.00g已捣碎样品于50mL离心管中，加入200μL混合内标标准溶液（100ng/mL），加入11mL乙腈，超声振荡提取2min，8000r/min匀浆提取30s，4000r/min离心5min，上清液转移至25mL的比色管中；另取一只50mL离心管加入11mL乙腈,洗涤匀浆刀头10 s，洗涤液转入前一离心管中，用玻棒捣碎离心管中沉淀，涡旋混匀器上振荡30s，超声振荡5min，4000r/min离心5min，上清液合并至25mL比色管中，用乙腈定容至25.0mL，摇匀备用。

1.3.2 样品净化

移取5.00mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上，用KD浓缩瓶接收流出液，4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱，收集全部流出液，45℃旋转蒸发至约1mL，残液用乙腈定容至1.00mL，超声波振荡5min，加入1.0mL5mmol/L乙酸铵，超声波振荡1min，样液经0.2μm滤膜过滤后供液相色谱串联质谱测定。

1.4 标准溶液的配制

1.4.1混合标准储备液：分别准确吸取10μL孔雀石绿和隐色孔雀石绿标准品至1mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，配制成浓度为1μg/mL的标准储备液。

1.4.2混合标准储备液：准确吸取10μL孔雀石绿和隐色孔雀石绿混合标准储备液（1.4.1）至1mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，配制成浓度为0.01μg/mL的标准储备液。

1.4.3混合内标标准溶液：用乙腈稀释内标标准品，配制成0.1μg/mL的内标标准溶液。

1.4.4精确吸取一定量的混合标准储备液（1.4.2）和混合内标标准溶液（1.4.3），用乙腈+0.1%甲酸溶液（1+1）稀释成质量浓度为0.1μg/L、0.5μg/L、1μg/L、2μg/L、5μg/L的标准工作溶液，每毫升中含有氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石绿各2ng。

2. 结果

2.1 标准品的 MRM 色谱图

1.0 μg/L 标准溶液的 MRM 色谱图

（1. 孔雀石绿；孔雀石绿-D5 2. 隐色孔雀石绿；隐色孔雀石绿-D6）

2.2 线性关系

将浓度为 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0μg/L的混合标准工作液按1.2中的分析条件进行测定，孔雀石绿以氘代孔雀石绿为内标物质计算，隐色孔雀石绿以氘代隐色孔雀石绿为内标物质计算；以浓度比为横坐标，峰面积比为纵坐标，绘制校准曲线如下图所示：

孔雀石绿的标准工作曲线

隐色孔雀石绿的标准工作曲线

所得校准曲线线性关系良好，线性方程及相关系数见下表。

序号	名称	校准曲线	线性范围（μg/L）	相关系数r²
1	孔雀石绿	Y=0.436507X+0.0156128	0.1-5.0	0.9998455
2	隐色孔雀石绿	Y=0.403218X-0.00873880	0.1-5.0	0.9993515

2.3孔雀石绿及其代谢物的回收率和精密度RSD

将鲤鱼空白样品进行 0.5μg/kg、1μg/kg、5μg/kg 浓度加标后，按照上述前处理方法处理后上机，平行6份样品考察回收率和精密度RSD，具体结果如下：

目标物	加标浓度（μg/kg）	回收率范围（%）	RSD（%）
孔雀石绿	0.5	84.1-92.0	3.6
	1	95.0-104.2	3.9
	5	103.0-106.6	2.7
隐色孔雀石绿	0.5	78.8-113.2	13.8
	1	78.8-89.1	5.4
	5	72.4-84.0	5.0

3. 结论

参照国标 GB/T 19857-2005，建立了水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿的测定方法。采用中性氧化铝固相萃取小柱对鲤鱼样品进行净化，Shim-pack Scepter C18 色谱柱进行分离，岛津 LCMS-8050串联质谱检测分析，内标法定量。对空白样品0.5μg/kg、1μg/kg、5μg/kg浓度加标后，按照上述前处理方法处理后上机，平行6份样品考察回收率和精密度RSD，结果显示本方法回收率高，重现性好，完全符合GB/T 19857-2005、GB/T 27404-2008标准要求，该方法适用于水产品中孔雀石绿及其代谢物的测定。

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