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【我们不一YOUNG】+液相分析中如何进行方法开发的流程分享
通标小菜鸟
2024/07/24
私聊
液相色谱(LC)
我们要开发一个
液相色谱
方法的话,往往是因为原方法分离效果差;或者没人做过,查不到具体方法;再或者是未知化合物的方法开发。我们今天就介绍一下
液相色谱
的方法开发流程。
我们就以未知化合物为例。
分离模式的选择我们先测试样品的溶解性:如果在烷烃试剂中溶解性好,那么可首选正相模式开发方法,色谱柱主要以硅胶柱为主,流动相可以选择正己烷-乙醇、二氯甲烷-甲醇;如果在二氯甲烷或乙醇中溶解性好,那么可以选用正相模式,或者反相模式中的纯有机模式,色谱柱可以用硅胶柱、C18或C8,反相的流动相可以用甲醇-乙腈、乙腈-二氯甲烷。
如果在水、甲醇或乙腈中溶解性好,那么可以选用反相模式、Hilic模式或离子交换模式,反相流动相可以用水-甲醇、水-乙腈,HILIC的流动相可以用乙腈-水,离子交换流动相可以用缓冲盐浓度梯度洗脱、或pH的梯度洗脱。
如果是分析酸性化合物,我们选择流动相的pH应低于其pKa至少2个pH单位;如果是分析碱性化合物,流动相的pH应高于其pKa至少2个pH单位。
确定待测物结构上是否有紫外强吸收化学键,可以用DAD检测器看一下紫外吸收强度范围,选取合适的分析波长;如果结构上没有双键,则不能用紫外检测器,可以考虑示差折光检测器(RI);如果待测物沸点较高(大于400℃),则可以选择蒸发光散射检测器(ELSD)或电喷雾检测器(CAD);如果需要确定分子量,可以连接质谱检测器。
我们可以先跑一个大梯度,比如反相用水和乙腈流动相,可以用乙腈的比例从5%逐渐增至95%,根据出峰情况,再去优化放缓梯度。
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