仪器信息网APP
选仪器、听讲座、看资讯
立即体验
APP内打开
回版面
评论
收藏
点赞
拍砖
举报
取消
发布
当前位置:
仪器社区
>
波谱
>
核磁共振技术(NMR)
>
帖子详情
【“仪”起享奥运】生物分子NMR:蛋白质动力学研究的同位素标记法
通标小菜鸟
2024/08/13
私聊
核磁共振技术(NMR)
长期以来,
液相
核磁共振光谱测定蛋白质结构都是依赖于
13
C和
15
N均匀稳定的同位素富集,以减少共振重叠,并允许在尽可能多的原子位点上进行多距离和多角度的限制,以方便计算最佳的三维结构模型。近年来,这些标记技术的优化增加了可修改的蛋白质尺寸范围,提升了三维结构的质量,简化了实验数据的分析过程。同时,蛋白质动力学领域的发展也得益于同位素标记技术的进步,该技术使研究人员能够在更广阔的时间尺度范围内研究更大体积的蛋白质运动特性,同时更准确地描述蛋白质的运动轨迹。在许多方面,动力学同位素标记技术的进步映射了结构研究中所使用的技术的进展。然而,为研究蛋白质动力学而设计的自旋弛豫实验对残留标记有独特的要求,需要同位素富集技术的极速发展来更好地应用于这些先进的研究课题。
动力学中孤立自旋系统的需求
液相
核磁共振是一种强大的方法,通过测量所需核的弛豫率来表征蛋白质在大范围时间尺度上的运动。如果将目标蛋白质的位置视为一个孤立的自旋对,那么这些弛豫实验的设计以及数据的分析和解释都将大大简化。在这种情况下,脉冲序列设计不需要考虑和操作多个不需要的相干路径,得到的弛豫率可以直接从峰值强度的单指数衰减剖面测量。然而,多个大型单键耦合的存在会通过多指数弛豫路径和信号噪声退化,使实验结果复杂化。正因为如此,常规的标记方法大多都是通过提供一种标记蛋白质中不同的孤立自旋对的同位素的方法,这样单键标量(J)耦合就不会构成实验数据分析上的困扰了。
15
N-标记
迄今为止,大多数动力学研究都是通过单一的
15
N的富集来实现的。
15
N是一个很好的研究方向,细胞生长所需的必要氮元素可以通过易于获得的富含
15
N的微量或富含氮元素的生长培养基来控制,使样品制备变得容易。单一的
15
N标记构成了一个孤立的自旋系统(
1
H-
15
N),使得其很适合进行弛豫实验。无论在蛋白质的主链还是侧链中,每一个
15
N的位置都与另一个
15
N的原子通过至少两个键分开。因此,没有能导致复杂的多指数弛豫行为的
1
J
NN
耦合,这类耦合将很难精确测量,并会影响对相关运动的解释。
然而,
15
N的富集本身并不能提供蛋白质运动的完整图像。氮只占蛋白质主链的1/3,而且在20个氨基酸中也仅有6个侧链中含有氮元素。因此,除了少数可选择的位置(Asn天冬酰胺、Gln谷氨酰胺、His组氨酸、Trp色氨酸、Lys赖氨酸和Arg精氨酸),
15
N弛豫实验不允许大量在蛋白质尺寸范围内的动态覆盖,以防遮挡主、侧链的运动全貌,尤其是酰胺弛豫可能对蛋白质疏水核心的运动相对不敏感。同时人们还注意到,通过监测酰胺位置的弛豫,蛋白质主干的某些运动行为是不会被检测到的。尽管如此,
15
N蛋白质标记的便捷性、现有的强大实验积累以及氮元素对结构、静电和氢键效应的敏感性使
15
N成为现代动力学研究的重要组成部分。
13
C-标记
从表面上看,碳元素的弛豫实验为利用核磁共振光谱进行分子动力学研究提供了许多额外的机会。每个氨基酸中碳的丰度为酶动力学的研究提供了更多的探针。这些碳包含在主链和侧链中,能够提供整个蛋白质的动态信息。甲基残基通常埋在疏水核心中,特别适合提供蛋白质折叠和稳定性的动态过程提供信息。
13
C的化学位移,特别是C
α
,对蛋白质二级结构的依赖比酰胺中的氮更加明显,这使得从某些自旋弛豫实验中获得的化学位移变化更容易被理解。
不幸的是,理想的碳标记方法并不像氮标记方法那样直接。蛋白质中大量的碳元素能够覆盖在蛋白质动力学研究中的绝大多数位置,这也是给其研究带来的最大阻碍;大量的碳原子意味着几乎所有的碳原子都与另一个碳原子相邻。因此,统一标记的
13
C蛋白样品导致许多残基存在大量的
13
C-
13
C偶联,使得本应能够直接解释弛豫行为的数据在许多情况下变得难以处理。唯一不受上述
1
J
CC
偶联影响的位置是蛋氨酸上的甲基,它被硫原子与蛋白质的其他部分隔开来。因此,在统一的
13
C标记蛋白中,对动力学的研究受到很多限制。虽然蛋氨酸的弛豫数据可能非常有用,但它不能提供从碳标记方案中获得更加完整的动态覆盖水平。正因为如此,许多利用已知细菌代谢途径的同位素标记方法已经被开发出来。
一种用于分离
13
C标志物的方法是使用15%的
13
C-醋酸盐进行部分标记,其余保留为
12
C。这种方法了可以将
13
C标志物稀释到一定的水平,使松弛实验可行,但由于标记蛋白的比例减少,信噪比也会随之降低。
采用[3-
13
C]丙酮酸作为唯一的碳来源,在>90%掺入水平下,可以实现Leu
δ
、Val
γ
、 和Ile
γ
的
13
C标记。更重要的是,同位素标记在很大程度上没有打乱直接成键的碳,从而使得我们可以对这些残基进行弛豫测量。因此,在这些甲基的位置就能观察到良好的单噪声和单指数弛豫行为了。和蛋氨酸一样,这些残基可以让我们了解蛋白质在疏水核中的运动轨迹。
α-酮酸的使用也为生产
13
C-甲基标记的氨基酸提供了一种经济有效的方法,这种氨基酸也与其他位置上高水平氘化的碳兼容。采用氘化方法可以在比其他方法更大的蛋白质系统上进行动力学研究。这种方法的另一个好处是
13
C标志物的有序性最高,从而能最大限度地减少上述由于
13
C-
13
C偶联导致的问题。
在营养缺陷型细胞系中使用1或2位置标记的甘油允许在整个蛋白质侧链的大多数碳上掺入交替标记。通常,需要两个蛋白质样品才能尽可能完整地覆盖原子位置。芳香族残基可以补充甲基基团获得的数据,因为它们通常也存在于疏水核心中。鉴于存在的强J偶联以及小范围的化学位移,这些残基中的特定标记尤为重要。早期研究表明,在[2-
13
C]位置甘油上的生长将导致大多数氨基酸中交替碳的同位素富集,包括 Phe、Tyr 和 Trp 中的孤立芳香碳。 在[1,3-
13
C]位置甘油上的生长将发生相反的标记模式。对此的替代方法是使用[1-
13
C]-葡萄糖作为唯一的碳元素来源,芳香环会被标记在Phe
δ
、Tyr
δ
、His
δ2/ε1
和Trp
δ1/ε3
这几个位置上。[1-
13
C]-葡萄糖标记法是非常实用且高效的,因为它不仅更经济实惠,并且能够得到更高的蛋白质产量。
最近的研究则表明,[1-
13
C]-葡萄糖还会导致Ala丙氨酸、Val缬氨酸、Leu亮氨酸、Met甲硫氨酸和Ile异亮氨酸的甲基残基富集率达到约45%,这些残基会被两个或多个键与其他
13
C标记的原子隔开。同时还发现,使用[2-
13
C]-葡萄糖作为唯一碳元素来源的表达显示会导致在C
α
位点富集率达到20-45%,不会标记 C'位点,仅仅会标记Leu、Val和Ile的C
β
位点。这种标记允许CPMG弛豫实验在C
α
位置上进行,提供更多的数据来补充常见
15
N CPMG实验得到的结论。
最后,同位素标记可以通过将所需的标记物氨基酸直接引入生长培养基中来精准地掺入。通常,为了避免标记物扰乱或者被稀释,所需的氨基酸会被包含在含有所有其他未被标记的氨基酸混合物中,只是考虑到被标记的同位素的位置,合成过程可能非常耗时。该技术已被证明在动力学和结构研究中很有用,并且最近已用于大体积蛋白质的NMR结构测定。
相关话题
1
【“仪”起享奥运】重大突破--人工智能预测蛋白质折叠技术
2
【“仪”起享奥运】蛋白质稳态技术中蛋白质折叠状态的测量与 分析方法
3
有关NMR的S/g值计算
4
【“仪”起享奥运】 应用文档 - 磁共振 TD-NMR可用于测定面食的不同配方
5
【“仪”起享奥运】NMR成像提供了有关种子萌发过程的更佳洞察
近期热榜
【官方邀请】高效液相色谱使用情况有奖调研
【中秋佳节】 在一起月更圆!
一个“不符合”难住新领导
第三届微课大赛投票进行中ing
热门活动
第三届微课大赛投票进行中ing
【仪采通】仪器采购更轻松
猜你喜欢
最新推荐
热门推荐
更多推荐
【求助】13C-NMR中,中心频率处的负峰
2007/01/26
【求助】关于叠氮亚甲基、甲基的分裂
2008/05/15
求解一张氢谱
求助
2014/09/02
求助3D匀场的详细步骤
求助
2013/09/16
有关核磁管的问题
2005/12/26
求问核磁问题: 调了标准氢谱之后就无法扫碳谱?
新手求助
2015/10/20
【求助】HETCOR怎么做不出来?scale outside boundaries?
2007/03/27
金属硅中铜的检测,知道的请进.
2005/03/16
核磁活泼氢信号出不来
求助
2024/09/16
【金秋计划】核磁共振技术基础知识
分享
2024/09/12
【金秋计划】+提高固体NMR的灵敏度的方法有哪些?
分享
2024/09/11
【金秋计划】+固体NMR的应用
分享
2024/09/11
【金秋计划】+液体核磁共振实验中的常见技术难题及解决办法
分享
2024/09/11
【金秋计划】+配制样品为什么要用氘代试剂?怎样选择氘代试剂?
分享
2024/09/11
【金秋计划】+核磁共振仪有几种探头?
分享
2024/09/11
【金秋计划】+解析合成化合物的谱、植物中提取化合物的谱和未知化合物的谱,思路有什么不同?
分享
2024/09/10
【金秋计划】当没有合适的基质时可以用标准加入法来试试看
第十七届原创
2024/09/13
原子吸收火焰法测定土壤中六价铬所用质控样值一直在衰减
求助
2024/09/12
关气瓶是先关总阀还是先关减压阀?
求助
2024/09/14
基线(随机出现)突跃有哪些原因?
求助
2024/09/12
数据和结果
求助
2024/09/11
液质有什么好项目可以做
讨论
2024/09/11
委托加工,条形码到底该用谁的?
求助
2024/09/13
恒温振荡器如何校准?
已应助
2024/09/13
Doubling the resolution of fluorescence-lifetime single-molecule localization microscopy with image scanning microscopy
悬赏帖
2024/08/13
【“仪”起享奥运】如何通过NMR分析蛋白是否折叠?
分享
2024/08/13
ICP-OES检测铜
原创
2024/08/13
欣赏山野花
原创
2024/08/13
海产动物食品罐头可以添加色素吗
已应助
2024/08/13
双脚跳使让你身心更健康
原创
2024/08/13
黄豆根治脚后跟痛食疗方法
原创
2024/08/13
推荐治风湿腿痛中医药方
原创
2024/08/13
品牌合作伙伴
岛津
日立科学仪器
珀金埃尔默仪器(上海)有限公司(PerkinElmer)
日本电子株式会社
丹纳赫
安捷伦
赛默飞世尔科技
普析通用
欧波同
天美
天瑞仪器
德国耶拿
海能技术
马尔文帕纳科
磐诺科技
上海仪电科仪
梅特勒托利多
聚光科技
莱伯泰科
盛瀚
多宁生物
丹东百特
科哲
卓立汉光
屹尧科技
华谱科仪
宝德仪器
优莱博
HORIBA
布鲁克核磁
举报帖子
执行举报
点赞用户
好友列表
加载中...
正在为您切换请稍后...