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高效液相色谱技能篇|关于加校正因子对照法的小知识（欧洲药典及欧洲药典质量标准的起草技术指南）

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2024/09/08

液相色谱（LC）

根据欧洲药典2.2.46 Chromatographic separation techniques提到，检测器灵敏度是指进入检测器的流动相中每单位浓度或单位质量的物质所输出的信号。相对检测器响应因子（通常称为响应系数）表示检测器对特定物质的灵敏度相对于参考物质的灵敏度。校正因子是响应因子的倒数。在对相关物质进行检测时，应使用各论中指明的任何校正系数（即当响应系数超出 0.8-1.2 范围时）。

01.什么是相对检测器响应因子（Relative Response Factor，RRF）？

待测杂质与参照物质（通常是药物的主成分）的色谱响应之比。它用于校正由于杂质和主成分在检测器上的响应不同而导致的定量误差。计算公式：RRF=（Ai/As）×（Cs/Ci）········································式1其中：Ai：杂质峰面积；As：供试品的峰面积；Cs：供试品的浓度，mg/ml；Ci：杂质的浓度，mg/ml根据通则的指南，当杂质与供试品的响应值之比落在0.8~1.2范围之外，必须对杂质峰面积进行校正，即在0.8~1.2范围内不考虑响应值的差异。因此，在所有情况下，对于特定杂质，在各论的验证过程中检测到超出该范围的响应因子，即校正因子也在该范围之外，则在各论的有关物质部分中说明相应的校正因子。 02.欧洲药典质量标准的起草技术指南（第八版）中关于响应因子（RRF）的相关描述1）任何情况下，如果校正因子（CFs）在0.8～1.25（相应的响应因子1.2～0.8）之间，可不列入各论。 2）响应因子可以通过配制规定浓度的杂质和待测物质溶液，并通过LC/UV 在规定波长和流速条件下测定获得。杂质和待测物浓度应处于同一数量级并用标准曲线法测定，标准曲线点为杂质的可接受标准对应的浓度附近的浓度点。可以使用整个线性范围内的面积比的平均值或各线性回归方程的斜率比计算。

基于这段话的理解：在色谱分析中需要准备已知浓度的杂质溶液和待测物质（主成分）溶液。这些溶液的浓度应该在同一数量级，以确保测量结果的可比性。

a.色谱/紫外检测（LC/UV）测量：

使用液相色谱（LC）结合紫外（UV）检测器，在特定的波长和流速条件下对这些溶液进行测量。这些条件应该根据分析方法的要求来设定。

b.校准曲线的构建：

通过在与杂质可接受标准相对应的浓度附近确定几个点来构建校准曲线。这些点应该覆盖线性响应的范围，以确保曲线的准确性。

c.响应因子的计算：

计算响应因子时，可以使用在整个线性范围内峰面积比的平均值，或者使用各自线性回归方程斜率的比值。具体来说：

峰面积比：比较杂质和待测物质的色谱峰面积，计算它们的比值。

斜率比：通过线性回归分析，比较杂质和待测物质的校准曲线斜率。

3）在确定响应因子时考虑杂质和待测物质的形式（碱/酸，或成盐）也很重要，并在它们以不同形式存在时依据分子量比值进行额外校正。可以通过确保Ci（杂质浓度）表示为与待测物相同的形式（例如作为碱/酸，或成盐形式）来完成校正，前提是该杂质实际上可以以该形式存在。基于这段话的理解：在色谱分析中确定响应因子（Response Factor, RF）时，需要考虑的一个重要因素，即待测物质（主成分）和杂质在色谱分析中可能存在的不同化学形式（如游离碱/酸或盐）对响应因子的影响。这里的关键是理解化学形式对色谱响应的影响，并在计算响应因子时进行适当的校正。a.化学形式的影响：在色谱分析中，待测物质和杂质可能以不同的化学形式存在，例如，它们可能是游离的碱或酸，或者以盐的形式存在。不同的化学形式可能会影响色谱行为，包括保留时间、峰形和检测器响应等。b.分子量比的校正：当待测物质和杂质以不同的化学形式存在时，它们的分子量会有所不同。这可能会影响色谱响应，因为检测器的响应可能与分子的质量和/或结构有关。为了校正这种差异，需要调整响应因子的计算，确保它反映了在相同化学形式下待测物质和杂质的相对响应。这通常通过调整待测物质的浓度（Ci）来实现，使其与杂质的化学形式相匹配。c.实际操作：在计算响应因子时，需要将待测物质的浓度（Ci）转换为与杂质相同的化学形式。例如，如果杂质以盐的形式存在，而待测物质以游离碱的形式存在，那么在计算响应因子时，需要将待测物质的浓度调整为相当于盐的形式。这种调整可以通过化学当量转换来实现，确保在比较待测物质和杂质的色谱响应时，它们处于相同的化学状态。4）响应因子应在两个实验室使用相同的方案确定。如果有不同的紫外-可见检测器类型（二极管阵列检测器（DAD）和可变波长检测器（VWD）），也可以考虑用于该项测量。

基于这段话的理解：在色谱分析中确定响应因子（Response Factor, RF）时的两个重要方面：实验室间的一致性和检测器类型的选择。

a.实验室间的一致性

为了确保响应因子的准确性和可靠性，最好在两个或以上的实验室中使用相同的实验方案（protocol）来测定响应因子。这样做的目的是为了验证响应因子的重现性（reproducibility），即在不同实验室条件下能否得到一致的结果。

b.检测器的选择

二极管阵列检测器（DAD）：这种检测器可以在多个波长同时检测样品的吸光度，通常用于获取色谱峰的光谱信息，有助于峰纯度的确认和复杂样品的分析。

可变波长检测器（VWD）：这种检测器在特定的单一波长下测量样品的吸光度，适用于对特定化合物的定量分析。

c.测定响应因子时的考虑：

当测定响应因子时，可以考虑使用这两种检测器中的一种或两种。选择的依据可能是样品的特性、分析的具体要求或实验室的设备条件。

使用不同类型的检测器可能对响应因子的测定结果有影响，因为不同检测器对同一化合物的响应可能存在差异。因此，选择检测器时需要考虑其对分析结果的影响。

5）杂质和待测物的称量值应当依据各自的纯度校正。如果杂质的可用量不能满足试验测定，则可以使用分析报告中的数值。如果可以获得足够的物料，应事前确定杂质和待测物质的色谱纯度和水/溶剂含量。可以用以下公式对临时值赋值：含量（%）=[100-（水分+溶剂）]×色谱纯度（%）/100

基于这段话的理解：在色谱分析中，对杂质和待测物质（主成分）进行称量时需要考虑的纯度校正问题。

a.称量的纯度校正：

在色谱分析中，对杂质和待测物质进行称量时，需要根据它们各自的纯度进行校正。这是因为实际称量的物质质量包含了一定比例的杂质，而这部分杂质在分析中并不需要考虑。

b.实验测定与分析报告值：

如果手头上的杂质量不足以进行实验测定（例如，杂质非常稀少或昂贵），则可以使用杂质的标准分析报告中的值来进行计算。

如果有足够的杂质材料可供实验，应事先确定杂质的色谱纯度和水分/溶剂含量。色谱纯度是指杂质中活性成分的比例，水分/溶剂含量则是指杂质中水分或溶剂的比例。

c.色谱纯度和水分/溶剂含量的测定：

色谱纯度通常通过色谱分析（如高效液相色谱，HPLC）来确定，通过比较杂质或待测物质的色谱峰与总峰面积的比例来计算。

水分/溶剂含量可以通过适当的分析方法（如卡尔费休法、气相色谱法等）来测定。

6）当只有少量杂质可使用，最好使用样品量少的测定方法（例如：水/溶剂的热重分析，库伦法测定水分和通过注入杂质的浓溶液的LC 法）。可以采用适当的替代方法，如结合qNMR 与LC 数据，或比较LC-UV 和LC-CAD。

基于这段话的理解：在色谱分析中，当可用的杂质样品量非常有限时，如何选择和应用合适的分析方法。

a.特定分析技术的应用：热重分析（Thermogravimetric Analysis, TGA）：这是一种用于测定样品中水分或溶剂含量的技术。通过测量样品在受控加热过程中的质量变化，可以准确测定水分或溶剂的百分比。库仑法（Coulterometry）：这是一种用于测定样品中水分含量的技术，特别适用于需要高精度水分测定的场合。液相色谱（Liquid Chromatography, LC）：通过注射杂质的浓溶液，可以使用LC来估计其纯度。这种方法可以在不消耗大量样品的情况下，通过色谱峰的分析来评估杂质的纯度。b.替代方法：量子核磁共振（Quantitative Nuclear Magnetic Resonance, qNMR）与液相色谱（LC）数据的结合：qNMR可以提供关于分子结构和组成的详细信息，而LC则可以提供关于样品纯度和组分分布的信息。将这两种技术的数据结合起来，可以更全面地评估杂质的特性。LC-紫外检测器（LC-UV）与LC-电化学检测器（LC-CAD）的比较：LC-UV检测器通过测量样品在紫外光区的吸收来检测样品，而LC-CAD则通过测量电化学反应产生的电流来检测样品。这两种检测器对不同化合物的响应可能不同，通过比较它们的结果，可以提供关于样品纯度和组成的额外信息。c.分析方法的选择：在选择分析方法时，需要考虑样品的可用量、所需的分析信息类型（如纯度、水分含量、分子结构等），以及实验室的设备条件。应选择那些能够在有限样品量下提供最准确和最全面分析结果的方法。 总结一下（上面的废话有点多，直接看总结即可）：

在色谱分析中，为了确保分析结果的准确性，我们需要特别关注响应因子（RRF）的测定。响应因子是衡量检测器对不同物质响应差异的一个指标，通常通过比较杂质和主成分在相同条件下的色谱峰面积来计算。当杂质的响应与主成分的响应比值超出0.8到1.2的范围时，就需要使用校正因子来调整，以补偿这种差异。

为了得到可靠的响应因子，我们通常会在两个实验室使用相同的方法进行测定，以验证结果的一致性。在实验中，我们会选择适当的检测器，比如二极管阵列检测器（DAD）或可变波长检测器（VWD），并确保待测物质和杂质的浓度在同一数量级，以便进行有效的比较。

此外，我们还会构建校准曲线，通过在特定浓度范围内测定多个点来完成。这些点应该覆盖杂质可接受标准的浓度，以确保曲线的准确性。在计算响应因子时，我们可以使用峰面积比的平均值或者线性回归方程斜率的比值。

如果手头的杂质样品量有限，我们会优先选择样品量需求小的分析方法，比如热重分析或库仑法来测定水分和溶剂含量，或者使用浓溶液的液相色谱法来估计纯度。在某些情况下，我们还可以结合量子核磁共振（qNMR）和液相色谱（LC）的数据，或者比较LC-UV和LC-CAD的结果，以获得更全面的信息。

总之，通过这些细致的步骤和方法，我们可以确保即使在样品量有限的情况下，也能准确地测定响应因子，从而提高色谱分析结果的可靠性。

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