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【金秋计划】竹节香附素A靶向TDP43激活cGAS-STING通路增强抗肿瘤免疫

城头变幻大王骑

2024/09/10

中药/天然药检测

免疫抑制性肿瘤微环境（immunosuppressive tumor microenvironment, ITME）的存在是导致当前肿瘤免疫治疗效果不佳的主要原因之一，诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death，ICD）已成为改善ITME的有效策略。竹节香附素A（Raddeanin A，RA）是中药竹节香附中天然的三萜皂苷，对肝癌、卵巢癌、肺癌等均具有良好的抗肿瘤活性，然而目前RA的抗癌作用机制尚未明确，特别是在抗肿瘤免疫方面。

竹节香附素A可直接靶向反式激活应答DNA结合蛋白-43（transactive responsive DNA-binding protein 43, TDP-43），激活mtDNA-cGAS/STING通路诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡，促进树突状细胞依赖性CD8+ T细胞的激活，从而为临床上肿瘤的免疫治疗提供了新思路。

1、筛选确定竹节香附素A是潜在ICD诱导剂HMGB1是公认的ICD标志物之一，为了确定可能诱导肿瘤细胞死亡和增强T细胞反应的新化合物，作者通过建立了HMGB1-Gluc报告基因筛选模型，结合三种细胞共培养体系（小鼠B16-OVA细胞、小鼠骨髓来源的树突状细胞BMDCs和CD8+ T细胞杂交瘤细胞B3Z），从天然生物活性小分子化合物库（2569种天然产物）中发现竹节香附素A表现出良好的诱导ICD和激活T细胞的活性。此外，RA能显著提高共培养的CD8+ T细胞分泌的IL-2、IFN-γ、GZMB和TNF-α水平，促进BMDCs成熟，增强其抗原呈递功能，在小鼠体内诱导产生免疫记忆效应。

2、竹节香附素A处理的肿瘤细胞促进树突状细胞介导的T细胞活化接下来，作者确定了RA处理的肿瘤细胞激活T细胞和DC的能力。结果显示在与RA预处理的肿瘤细胞共培养的B3Z T细胞中，T细胞来源的IL-2和IFN-γ的上清液水平显著上调，同时伴随着T细胞活化标志物CD69的表达水平升高。由于DC在肿瘤抗原与T细胞的交叉呈递中起着关键作用，作者发现RA处理的肿瘤细胞显著增加了 BMDC上激活标志物的表面表达。数据表明RA治疗的肿瘤细胞促进DCs成熟和随后的CD8 T细胞活化（

3、竹节香附素A通过激活抗肿瘤免疫抑制肿瘤生长接着，作者通过体内研究发现，RA抑制MC38荷瘤小鼠肿瘤大小和肿瘤重量。此外，肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）谱分析显示，RA显著升高肿瘤浸润性 CD8 T 细胞和 CD103 CD11 DC的数量。同时， RA增加肿瘤微环境（TME）中CD8 T细胞效应分子GZMB和IFN-γ的水平，这意味着RA增强了体内有效T细胞的活化。而在T细胞功能缺陷的BALB / c裸鼠中，RA未能抑制MC38的肿瘤生长，通过细胞色素c（Cyt c）耗尽了DC消除了 RA 对 MC38肿瘤生长的抑制，表明抗原呈递对 RA 介导的抗肿瘤作用至关重要，RA可以通过DCs和CD8 T细胞依赖性方式抑制肿瘤生长

4、竹节香附素A触发cGAS/STING依赖性NF-κB和I型IFN信号激活为了研究RA如何诱导肿瘤细胞ICD，作者开展了RNA-seq，发现NF-κB和I型IFN信号转导相关基因显著富集，并通过qPCR证实。报告基因测定同样表明RA触发了MC38细胞中的NF-κB和I型IFN通路激活。为了鉴定调节RA介导的NF-κB和I型IFN激活的先天免疫传感器，作者删除部分可调节 NF-kB和 I 型IFN通路的已知基因，发现缺乏细胞质DNA传感器cGAS和STING导致 NF-kB和I型IFN通路显著减弱。此外，cGAS和STING特异性抑制剂阻止 RA 处理的 MC38 细胞中 Ifnb1 和 Tnf 的表达，这些结果表明cGAS/STING是调节RA介导的肿瘤细胞免疫原性的重要免疫传感器（

5、竹节香附素A直接结合反式响应性DNA结合蛋白43（TDP43）为进一步研究RA调控cGAS/STING通路的机制，作者通过Pulldown+MS筛选RA在肿瘤细胞中的潜在结合蛋白，发现反式激活应答DNA结合蛋白-43（TDP-43）可能为RA诱导ICD的直接作用靶点。TDP-43是一种定位于细胞核的DNA和RNA结合蛋白，已有研究表明，TDP-43可在细胞核与细胞质间穿梭，且TDP-43的C端富含甘氨酸结构域，该结构域发生突变（A315T/Q331K）可诱导TDP-43进入线粒体并诱导释放mtDNA到细胞质中激活cGAS/STING。随后作者通过Pulldown+WB、CETSA和SPR等验证两者存在直接互作，分子对接和突变实验证实了结合位点

6、RA 触发 mtDNA 泄漏到细胞质中以激活 cGAS/STING 信号传导接下来，作者推测TDP-43可能有助于RA诱导的cGAS/STING信号转导上调。结果显示RA诱导的cGAS/STING下游信号分子的激活，而在TDP-43 KO细胞中被消除。RA触发的Ifnb1和Tnf表达也因TDP-43耗竭而显著降低。TDP-43 能够在细胞核和胞质溶胶之间穿梭，作者发现RA处理显著增加了线粒体中TDP-43的富集，导致线粒体功能损伤，而TDP-43的消耗阻止了RA介导的线粒体功能损伤。细胞免疫荧光显示RA 处理增加了细胞质mtDNA和cGAS之间的共定位，但TDP-43的耗竭中消除。这些发现可能表明与TDP-43结合的RA会触发线粒体不稳定和mtDNA泄漏到细胞质中，从而激活cGAS/STING信号传导

7、RA诱导免疫细胞浸润，增强抗PD1治疗疗效作者接着研究了RA和抗PD-1联合治疗在MC38肿瘤模型中是否具有协同抗肿瘤作用，结果显示RA与PD-1抗体的联合治疗实现了最佳的肿瘤生长抑制，且RA和抗PD-1抗体组合导致肿瘤浸润CD8 T细胞的比例高于单独使用任何一种疗法，且肿瘤浸润CD8 T细胞产生的效应分子（包括IFN-γ和GZMB）显著增加。此外，在RA和抗PD-1联合治疗后，MC38肿瘤浸润cDC1也显示CD40、CD80、CD86和MHC-II表达上调，这些发现表明，RA通过重编程免疫微环境增强了抗PD-1的抗肿瘤功效。而RA和抗PD-1联合治疗未能抑制TDP-43 KO小鼠的肿瘤生长，表明RA介导的肿瘤生长抑制主要是由于TDP-43依赖性调节。

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