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黄芪甲苷III靶向激活RXRa改善心力衰竭

城头变幻大王骑

2024/09/18

中药/天然药检测

心肌梗死性心力衰竭（HF）是世界范围内导致死亡和残疾的主要原因，心衰的特征是线粒体能量产生受损，类视黄醇X受体a（RXRa）是一种配体激活的转录因子，可以形成同型二聚体或异源二聚体，激活参与底物利用和氧化磷酸化的基因转录，是调节线粒体能量代谢的理想靶点。然而，目前缺乏具有高亲和力和特异性激活RXRa二聚体的激动剂。
黄芪甲苷是黄芪的主要有效成分，已有研究报道多种黄芪甲苷可以改善线粒体功能。其中黄芪甲苷Ⅳ已被观察到在腹膜纤维化中调节RXRa，这意味着黄芪甲苷家族的化合物具有激活RXRa和改善线粒体功能的潜力。因此，作者推测黄芪甲苷可能作为RXRa同型二聚体的潜在激动剂。此外，作者还研究了靶向RXRa的下游机制。

黄芪甲苷III（AS-III）是一种理想的直接靶向RXRa的激动剂。机制上，AS-III通过与RXRa相互作用激活RXRa二聚体，随后上调Ndufs4的转录。更重要的是，AS-III在体外和体内均有助于改善线粒体损伤和心功能障碍。该研究为心衰治疗提供了一种新的治疗策略，通过RXRa同型二聚体的反激活来上调Ndufs4并促进能量代谢。
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1、AS-III靶向RXRa，保护线粒体功能，发挥心脏保护作用
作者首先通过通过分子对接、表面等离子体共振（SPR）和微尺度热电泳（MST），鉴定出黄芪甲苷III（AS-III）是黄芪甲苷家族中亲和力最高的化合物（附件中）。SPR（图1a）和MST（图1b）结果显示AS-III特异性结合RXRa, KD值分别为3.05x10^-7和1.35x10^-7 mol/L，表明AS-III对RXR具有较高的亲和力。分子对接显示AS-III成功地停靠在二聚体的界面上（图1c）。对AS-III和RXRa蛋白进行均方根偏差（RMSD）模拟，结果表明它们在20 ns后达到稳定构象（图1d）。由于Ccl6受RXRa同型二聚体的转录调控，作者使用Ccl6启动子荧光素酶报告基因发现AS-III成功诱导了Ccl6的转录，表明AS-III是一种具有高亲和力的RXRa激动剂（附件）。采用体外氧葡萄糖剥夺/恢复（OGD/R）模型和体内左前降（LAD）结扎诱导HF模型确定了AS-III的保护作用，其作用与临床治疗HF的药物辛伐他汀相似（图1f和1g）。RXRa siRNA一致地逆转了AS-III依赖性的OGD/R损伤的保护作用，表明RXRa是AS-III的关键治疗靶点（图1e）。AS-III低剂量和高剂量的心脏保护作用相当，因此后续实验选择低剂量AS-III。随后采用透射电镜（TEM）和高效液相色谱（HPLC）检测心肌组织线粒体结构和功能，发现AS-III部分减轻线粒体损伤（图1h），AS-III改善了ATP浓度（图1i），表明它促进了HF小鼠ATP的产生。此外，western blotting显示AS-III在小鼠HF模型中抑制RXRa下调（图1j）。RNA测序分析结合qPCR验证证实，AS-III治疗上调了线粒体复合物亚基（Ndufs1-6和8），它们在模型组中严重受损（图1k和1）。

2、AS-III通过激活RXRa上调Ndufs4在心脏中的表达促进线粒体功能
越来越多的证据表明RXRa以依赖配体激活的方式调节线粒体复合体I，但其调控机制尚不明确。结合现有文献和前面的实验结果，作者推测RXRa通过Ndufs调控线粒体复合体I。作者利用HUMAN TFDB网站和Cytoscape软件确定Ndufs1-8是RXRa的直接转录靶基因。接着利用qPCR验证RXRa与Ndufs1-8之间的关系，发现RXRa siRNA下调Ndufs2、Ndufs4、Ndufs6和Ndufs8（图2a），而RXRa过表达上调了Ndufs4（图2b）。Western blot结果显示RXRa敲低显著降低了Ndufs4水平，RXRa过表达上调了Ndufs4水平（附件）。CUT和Tagseq分析用于确定RXRa和nduf4之间的调控关系，在Ndufs4基因中鉴定出RXRa结合序列（图2c）。此外，采用ChIP-qPCR方法证实RXRa与Ndufs4的互作。双荧光素酶报告基因实验发现RXRa激活了ndufs4驱动的荧光素酶基因表达。然而，在突变的Ndufs4荧光素酶活性中没有观察到这种差异（图2d）。这些结果支持RXRa直接靶向Ndufs4从而促进其转录的观点。qPCR结果显示在转染RXRa质粒的H9c2细胞中，9-cis RA（RXRa泛激动剂）能诱导Ndufs4表达，而LG100754（PPAR/RXR的激动剂，但是RXR同型二聚体的拮抗剂）不能诱导Ndufs4表达，且LG100754和9-cis RA共处理未能上调Ndufs4的表达，这表明RXRa以其同二聚体形式调控Ndufs4的转录（图2e）。进一步使用已知与RXRa同型二聚体结合的rxre -荧光素酶报告基因发现AS-III通过激活RXRa同型二聚体来发挥作用。与分子对接结果一致，AS-III可以诱导RXRa同型二聚体的转录激活（图2f）。此外，AS-III上调了Ndufs4 mRNA的表达，RXRa siRNA显著减弱了Ndufs4 mRNA的表达（图2g）。还有，AS-III改善了OGD/R损伤的线粒体结构和功能，在LAD模型中发现AS-III通过rxra - ndufs4介导的线粒体功能发挥心脏保护作用（图2h，i）。Western blot结果显示AS-III处理强烈诱导Ndufs4表达，然而这种效应在AAV-RXRa KD小鼠中被破坏（2j）。在AAV-RXRa KD + LAD结扎组，AS-III对线粒体的保护作用减弱（图2K）。

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