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【金秋计划】苦豆碱直接靶向VPS4A调控自噬抑制肺癌进展

  • 城头变幻大王骑
    2024/09/12
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中药/天然药检测

  • 苦豆碱(AloperineALO)是从苦豆子(Sophora alopecuroides L.)种子和叶中分离出来的一种喹诺里西啶型生物碱,据报道,它对多种类型的癌症表现出强大的抗肿瘤作用,包括结肠癌细胞、多发性骨髓瘤细胞和甲状腺癌细胞。已发现的机制主要包括诱导细胞凋亡、抑制侵袭和抑制自噬,表明这些过程起着至关重要的作用。然而,ALO对非小细胞肺癌NSCLC)的抗肿瘤作用的分子机制及其在NSCLC细胞中的特定分子靶点仍然很大程度上未知。

    2024621日,华中科技大学同济医学院附属协和医院胡德胜教授团队在Advanced ScienceIF=14.3)发表题为“Aloperine Suppresses Cancer Progression by Interacting with VPS4A to Inhibit Autophagosome-lysosome Fusion in NSCLC”的文章,发现ALO在体外和体内对NSCLC有良好的抗肿瘤作用,ALO诱导的细胞毒性是由于其抑制自噬的能力。从机制上讲,ALO直接结合并抑制VPS4A,诱导自噬体未封闭,抑制自噬体与溶酶体的融合,从而抑制伴随SQSTM1积累的自噬通量,升高的SQSTM1水平诱导ROS产生,随后引发NSCLC细胞凋亡。SQSTM1敲低消除了ALO诱导的ROS积累和细胞毒性。这些发现表明ALO是一种新型的晚期自噬抑制剂,可通过靶向VPS4A来触发肿瘤细胞死亡。

    1ALO抑制NSCLC细胞系的增殖和迁移

    为了评估ALO对体外NSCLC细胞的细胞毒性和抑制作用,作者用ALO处理人NSCLC细胞系H1299和小鼠NSCLC细胞系LLC细胞
    ,发现ALO抑制H1299LLC细胞的生长,增殖、诱导细胞周期停滞,并通过抑制EMT过程来抑制体外细胞迁移和侵袭

    2ALO在体内发挥抗肿瘤作用

    为了评估ALO是否对体内NSCLC肿瘤生长有治疗作用,将H1299LLC细胞分别注射到BALB/c裸鼠C57BL/6小鼠皮下,建立皮下肿瘤模型。
    发现ALO显著抑制了H1299LLC衍生的皮下肿瘤生长。此外,ALO显著抑制了Kras G12D ; Trp53 fl/fl突变肺腺癌小鼠肿瘤生长,且无明显的副作用。




    3、鉴定ALO作为自噬调节剂

    进一步研究ALO的抗NSCLC分子机制,通过RNA-seq确定ALO治疗和未治疗的NSCLC细胞之间差异表达的基因,KEGG分析显示细胞周期通路富集,此外,ALO处理后自噬通路和相关基因富集,表明ALO可能调节自噬。接着作者使用透射电子显微镜在用 ALO 处理的细胞中观察到自噬囊泡(自噬溶酶体和自噬体)数量增加。LC3SQSTM1水平被广泛用作自噬的生物标志物,作者通过WB显示ALO增加了 LC3B-II/β-Actin的比率和SQSTM1的水平,表明ALO处理增强了自噬体的积累。


    4ALO作为晚期自噬抑制剂发挥作用

    已证实ALO能促进自噬体的积聚。然而,ALO是诱导自噬体的产生还是抑制自噬体的降解还有待进一步研究。
    为了区分这两种可能性,在SAR405ATG7 siRNA(通过抑制自噬体形成来抑制早期自噬)或bafilomycin A1BafA1)(通过损害溶酶体降解来抑制晚期自噬)的存在下用ALO处理NSCLC细胞,然后通过免疫印迹分析自噬通量。作者发现证实ALO抑制自噬体的降解。SQSTM1是一种选择性自噬受体,在自噬过程中被募集到吞噬细胞并被组成性降解。因此,SQSTM1通常用于间接反映细胞内的自噬通量。作者发现在用ALO处理细胞后,SQSTM1水平显著上调,这表明ALO可能抑制自噬通量。此外,免疫荧光同样证实ALO是一种晚期自噬抑制剂,且ALO抑制自噬体与溶酶体的融合。


    5ALO介导的SQSTM1积累引发ROS产生和细胞凋亡


    鉴于ALO被认定为晚期自噬抑制剂,作者ALO是否通过自噬诱导NSCLC细胞的细胞毒性。发现ALO给药诱导H1299LLC细胞中的LDH释放,证实ALO会诱导NSCLC细胞的细胞毒性。自噬抑制剂SAR405不能阻断ALO处理引起的细胞死亡,凋亡抑制剂Z-VAD-FMK,而不是铁死亡抑制剂(ferrostatin-1)或坏死性凋亡抑制剂(necrostatin),可以阻断ALO处理引起的细胞死亡。进一步流式细胞证实了ALO诱导NSCLC细胞凋亡。前面发现ALO抑制自噬通量,导致SQSTM1水平升高。考虑到据报道SQSTM1的积累会导致ROS生成,而过量的ROS促进细胞凋亡,作者推测并验证了ALO诱导的细胞凋亡是由SQSTM1积累介导的过量ROS生成触发的。




    6VPS4A被确定为ALO的直接靶标

    为了确定ALO发挥抗肿瘤作用的靶蛋白,作者采用DARTS+MS技术确定了ALO的直接靶点,发现ef1a1ef1a2VPS4A三个候选蛋白,免疫印迹确定VPS4AALO的潜在靶点,并进一步通过CETSASPR证实了ALOVPS4A的结合。
    VPS4AESCRT正常功能所必需的,而EGFR的降解需要ESCRT复合物,作者发现在ALO处理的H1299细胞中EGFR水平显著升高,这进一步证明VPS4AALO的细胞靶点。接着作者通过分子对接结合蛋白点突变实验确定ALOVPS4A中的特定结合位点,证实 VPS4A F153D263ALO的结合位点,DARTSCETSA证实野生型WT,而非突变型VPS4A能和ALO结合。




    7ALO通过靶向VPS4A诱导SQSTM1积累

    据报道,VPS4A的功能障碍与自噬体未封闭有关,这可能通过阻止STX17募集到自噬体膜上来抑制自噬体与溶酶体的融合。作者发现ALO处理和敲除VPS4A均导致 LC3点与STX17明显分离,表明ALO通过靶向VPS4A诱导自噬体未封闭。随后,将WT或突变 VPS4A的质粒导入H1299细胞确定ALO对细胞自噬的影响,证实了ALO通过与VPS4AF153D263位点结合来调节自噬过程。进一步体内实验结果同样表明ALO通过靶向VPS4A对体内NSCLC肿瘤生长发挥治疗作用。总之,ALO通过靶向VPS4A诱导未封闭的自噬体形成,从而抑制自噬体与溶酶体的融合,导致SQSTM1积累和ROS水平的升高,最终引发细胞凋亡的发生。




    8ALO增强NK细胞的细胞毒性和双特异性抗体在肿瘤治疗中的功效

    据报道,ESCRT抑制可增加癌细胞对细胞毒性淋巴细胞的敏感性,并提高癌细胞内颗粒酶B的水平。作者发现ALO增强了人类自然杀伤细胞系NK-92MI细胞对靶细胞的细胞毒性。进一步探讨ALO对体内NK细胞细胞毒活性的调节作用,发现给予ALO后,肿瘤和脾脏中颗粒酶B+NK细胞和穿孔素+NK细胞的百分比显著增加。YM101是一种阻断TGF-βPD-L1的双特异性抗体,在癌症中表现出强大的抗肿瘤活性。作者发现在LLC衍生的皮下肿瘤小鼠模型中,ALOYM101组合的疗效明显高于ALOYM101单药治疗,这些结果表明,ALO和免疫疗法的结合可能代表一种有前途的NSCLC治疗策略。




    总结

    该研究将ALO鉴定为一种新型的晚期自噬抑制剂,并从体外和体内分析证实了这一点。从机制上讲,ALOVPS4AF153D263氨基酸互作,导致未封闭的自噬体形成,从而抑制自噬体和溶酶体的融合。此外,ALO介导的自噬通量阻断会诱导SQSTM1的积累,从而促进过量的ROS产生,导致NSCLC细胞凋亡。总之,本研究将 ALO 鉴定为一种新型的晚期自噬抑制剂,可通过靶向VPS4A 来触发 NSCLC 细胞凋亡。
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