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【金秋计划】苦参碱衍生物直接靶向EWSR1改善肝纤维化

城头变幻大王骑

2024/09/12

中药/天然药检测

肝纤维化是慢性肝病发展的重要阶段，与肝硬化甚至癌症的进展密切相关，目前还没有批准用于临床的抗肝纤维化药物。苦参碱是苦参的活性成分，在动物模型中对急性肝损伤和肝纤维化有保护作用。该课题组前期开展了苦参碱衍生物作为抗肝纤维化剂的研究，鉴定出一系列苦参噻二唑衍生物和苦参丁醇衍生物在mRNA和蛋白质水平上抑制COL1A1，其中，化合物1广泛抑制多种纤维化相关蛋白的表达，体外表现出中等的抗纤维化活性。
2023年6月22日，中国医学科学院医药生物技术研究所宋丹青、何红伟、李迎红团队在J Med Chem（IF=7.3）上发表题为“Evolution and Discovery of Matrine Derivatives as a New Class of Anti-Hepatic Fibrosis Agents Targeting Ewing Sarcoma Breakpoint Region 1 (EWSR1)”的文章，研究以化合物1为先导化合物，进行新一轮的结构修饰和优化，制备了一系列新的苦参碱衍生物，发现化合物6k在细胞水平上对肝纤维化相关基因和蛋白质有显著抑制作用。基于活性的蛋白质分析（ABPP）测定表明，其可能直接与尤文肉瘤断点区域1（EWSR1）结合，从而调节肝纤维化。研究为肝纤维化的治疗提供了潜在的新靶点，并为将苦参碱衍生物药物开发成有前途的抗肝纤维化药物提供了强有力的信息。

1、结构修饰
作者首先以1为先导化合物，不断进行新一轮的结构修饰和优化，制备了23种新的三环基特林烷衍生物，制备流程如下。

2、结构活性关系（SAR）分析对COL1A1的抑制效果
接着作者分析了化合物结构及其对COL1A1启动子的抑制活性，用COL1A1启动子荧光素酶质粒pGL4.17-COL1A1P转染人肝星状细胞LX-2。随后对12个抑制效果最好的化合物（7b、7c、6c、6d、6f和6h?n）进行抗col1a1半抑制浓度（IC50）值的测试，其中6k的IC50值为14.5μM，选择性指数（SI）值为37.4，效价最高。

3、化合物6k抑制COL1A1 mRNA和蛋白水平的表达
接下来通过qRT-PCR测定7种活性化合物6c、6d、6f、6i、6k、6l和6m对COL1A1的抑制作用，其中5个化合物（6f、6i、6k、6l、6m）明显抑制COL1A1的mRNA表达。然后，在mRNA水平上揭示了它们对其他纤维化生物标志物的作用，发现化合物6l对CTGF没有抑制作用。同时，Western blot检测显示6k对COL1A1、α-SMA和MMP-2的产生抑制作用最高，因此选择6k作为代表性化合物进行进一步研究

4、化合物6k抑制HSC中肝纤维化基因和蛋白的表达
进一步验证6k对HSC细胞的抗纤维化作用，包括人LX-2和小鼠HSC- t6细胞系。化合物6k显著降低各种纤维化标志物的蛋白和mRNA水平。这些结果进一步表明，化合物6k在细胞水平上是一种有效的抗纤维化药物

5、化合物6k减轻胆管结扎（BDL）大鼠肝损伤及肝纤维化
作者进一步采用胆管结扎（BDL）大鼠模型验证6k的抗肝纤维化作用，发现口服化合物6k可有效降低AST、ALT、ALP、TBA和TBiL水平。

组织病理染色显示6k给药减少病理损伤。此外，化合物6k显著降低BDL诱导的羟脯氨酸水平（肝纤维化的严重程度指标）升高，降低纤维化基因的mRNA和蛋白表达。

此外，化合物6k降低α-SMA和lrat阳性共染色细胞的数量，表明化合物6k可以有效抑制BDL大鼠HSC的活化。

6、化合物6k可减轻Mdr2?/?小鼠的肝损伤和肝纤维化
Mdr2（一种管状磷脂翻转酶）的缺乏会破坏胆道磷脂分泌，导致潜在毒性胆汁酸的增加，从而诱导肝细胞损伤和肝纤维化。作者进一步采用Mdr2-/-大鼠模型验证6k的抗肝纤维化作用，发现口服化合物6k同样可以改善了肝脏病理改变，降低纤维化基因的mRNA和蛋白表达水平。因此，化合物6k减轻Mdr2?/?小鼠的肝损伤和肝纤维化。

7、转录组学揭示化合物6k影响的相关基因
作者进一步通过转录组测序分析了6k治疗BDL大鼠的基因表达谱的影响，GO分析显示共有差异基因参与多种生物学过程或信号通路，其中一些基因与肝纤维化或核转录因子调控密切相关，包括Col1a1等细胞外基质-受体相互作用相关蛋白。
图片

图7 转录组学揭示化合物6k影响的相关基因
8、化合物6k靶向EWSR1调控肝纤维化
作者采用ABPP技术进一步探索了化合物6k抑制肝纤维化作用的靶蛋白。根据SAR分析，使用6k作为药效团和生物素通过不同的接头连接，分别构建生物素化探针12a和12b，并证明两个探针均具备良好的抑制活性，可用作捕获靶蛋白的活性探针。质谱鉴定获得87个探针12a和12b共有的候选靶蛋白，其中EWSR1（一种经过充分研究的抗肿瘤靶点）和SFRP1在两组中丰度均较高，而生物素对照组未检测到。WB证实WSR1，而非SFRP1，与化合物6k具有稳定的结合作用。接下来，作者研究6k对EWSR1表达的影响，发现6k不影响EWSR1蛋白和mRNA表达，但明显抑制其下游基因Ctgf的mRNA表达，这些发现提示6k可能通过抑制EWSR1功能及其下游基因表达来改善肝纤维化（图8）。
EWS作为TET家族蛋白的一员，含有一个公认的RNA结合结构域，通过靶向microRNAs调控Col4a1和CTGF mRNA的表达。作者在LX-2细胞中过表达和敲低EWSR1，以确定EWSR1在肝纤维化中的作用，发现EWSR1过表达导致多种纤维化标志物mRNA和蛋白水平升高，下游靶点CTGF表达增加，而敲低EWSR1时，纤维化标志物下调。以上结果表明，EWSR1过表达可促进肝纤维化的发展，可能是化合物6k抑制LX-2细胞纤维化标志物表达的靶点，这种作用可能与6k抑制EWSR1功能，从而减弱对下游mRNA表达的促进有关（图9）。

总结
研究合成了一系列新的苦参碱衍生物，并评估了其在基因和蛋白质水平上对COL1A1、α-SMA和MMP-2的抑制作用。化合物6k不仅在细胞水平上显著抑制了纤维化基因和蛋白质的表达，而且在BDL模型和Mdr2敲除模型中也显示出优秀的治疗效果。此外，研究发现EWSR1为治疗肝纤维化的潜在靶点，化合物6k可能直接与EWSR1结合从而调节肝纤维化过程，这可能为三环苦参碱衍生物进一步发展为潜在的抗肝纤维化药物提供强有力的信息（图10）。

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