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【金秋计划】含笑内酯靶向KEAP1-NRF2互作抑制巨噬细胞铁死亡

  • 城头变幻大王骑
    2024/09/12
  • 私聊

中药/天然药检测



  • 含笑内酯(Micheliolide,MCL)是小白菊内酯衍生物,具有抗氧化和抗炎作用,在肿瘤和炎症疾病中发挥多种功能。先前的文献还表明MCL可作为NF-κB的特异性抑制剂,抑制炎症因子的表达。此外,还有研究发现MCL通过调节NF-κB通路来防止阿霉素诱导的心脏毒性。然而,MCL对动脉粥样硬化(AS)进展和巨噬细胞铁死亡的影响仍不清楚。


    2023年12月7日,哈尔滨医科大学第二附属医院贾海波团队在Redox Biol(IF=11.4)发表题为“MCL attenuates atherosclerosis by suppressing macrophage ferroptosis via targeting KEAP1/NRF2 interaction”的研究文章,发现MCL对AS具有保护作用。机制上,MCL 通过与 NRF2 竞争结合KEAP1的Arg483位点来促进KEAP1/NRF2解离,激活NRF2通路增加 GPX4和xCT来抑制巨噬细胞铁死亡和线粒体功能,减少炎症反应并改善了氧化应激,从而减缓AS的进展。






    Highlights


    1)MCL减弱AS的发展,减少了炎症反应并改善了氧化应激;


    2)MCL抑制巨噬细胞铁死亡和线粒体功能,从而减缓AS的进展;


    3)MCL通过激活NRF2通路增加GPX4和xCT来抑制铁死亡;


    4)MCL通过与NRF2竞争结合KEAP1的Arg483位点来促进KEAP1/NRF2解离。


    研究结果


    1、MCL给药减缓ApoE ?/?小鼠的AS进展


    作者首先研究了MCL是否对AS有保护作用,ApoE?/?小鼠被喂养补充有MCL的西式饮食16周,发现MCL不仅减轻AS的发展,而且还改善了ApoE?/?小鼠脂质水平和炎症反应




    2、MCL 抑制巨噬细胞铁死亡并改善动脉粥样硬化斑块中的氧化应激


    鉴于巨噬细胞铁死亡在AS发展中的重要作用,作者推测MCL是否可能通过抑制巨噬细胞铁死亡来改善AS,通过检测GPX4和xCT mRNA和蛋白水平,检测血清铁含量、MDA和4-HNE水平,结果均表明MCL可能通过抑制巨噬细胞铁死亡来延缓AS的发展






    3、MCL体外抑制巨噬细胞铁死亡及改善ox-LDL诱导的氧化应激


    已有研究报道ox-LDL可引起巨噬细胞铁死亡,作者发现MCL可增加ox-LDL处理的巨噬细胞的细胞活力并降低上清液中的LDH水平,且MCL预处理可显著防止巨噬细胞线粒体的超微结构变化,改善巨噬细胞中的脂质ROS水平,逆转巨噬细胞中降低的GPX4和xCT水平。此外,MCL降低ox-LDL处理的巨噬细胞中的MDA水平,升高SOD活性和GSH水平,降低ox-LDL 诱导的巨噬细胞中铁离子浓度的升高


    此外,作者还检测了线粒体功能,发现MCL显著改善ox-LDL引起的膜电位损失,改善线粒体功能。与仅用ox-LDL处理的细胞相比,用MCL孵育的ox-LDL处理的细胞的基础、最大和ATP偶联的线粒体耗氧率显著增加。这些数据表明MCL显著抑制巨噬细胞铁死亡,改善线粒体功能






    4、MCL 增强ox-LDL培养的巨噬细胞中NRF2核转位


    先前研究报道NRF2调节GPX4和xCT的转录,作者推测MCL是否可能激活NRF2通路从而增加巨噬细胞中的GPX4和xCT表达。结果发现MCL降低了细胞质裂解物中NRF2蛋白的表达,但显著增加细胞核裂解物中NRF2蛋白水平。此外,ChIP-qPCR实验发现MCL处理后NRF2对GPX4和xCT启动子序列的富集显著增加,这些数据表明MCL增强了NRF2核转位并增加了GPX4和xCT转录


    5、MCL通过激活NRF2通路抑制巨噬细胞铁死亡减轻AS


    为进一步证实MCL通过激活NRF2通路抑制巨噬细胞铁死亡,作者采用NRF2特异性抑制剂M385预处理巨噬细胞,发现MCL治疗后升高的GPX4和xCT蛋白表达被ML385显著消除,且ML385抑制NRF2可消除MCL对脂质ROS和线粒体损伤的保护作用,此外,ML385可消除MCL诱导的GSH水平和SOD活性。用Si-NRF2降低巨噬细胞中NRF2水平,结果与ML385一致。这些数据表明MCL通过激活NRF2通路抑制巨噬细胞铁死亡


    此外,为了证明MCL通过激活体内NRF2通路保护AS ,作者通过尾静脉给ApoE ?/?小鼠注射了AAV-sh-NRF2和AAV-sh-NC,同样发现MCL通过激活NRF2通路来保护动脉粥样硬化并改善炎症反应
    6、MCL抑制NFR2与KEAP1结合促进NRF2核转位


    NRF2活性主要受其与KEAP1相互作用的调节。在生理条件下,KEAP1可以与NRF2相互作用形成复合物,抑制NRF2的核易位,进而导致其通过泛素化降解。作者发现ox-LDL促进NRF2和KEAP1复合物的形成,而MCL抑制了这种作用。作者接着通过分子对接来预测MCL是否可以直接与KEAP1结合,发现MCL分别与KEAP1的Gly364、Asn414、Arg483 和Ala556结合。进一步免疫沉淀和免疫荧光实验表明KEAP1-R483S突变体消除了MCL促进NRF2核转位的作用,表明MCL通过竞争性结合KEAP1的Arg483位点促进 KEAP1/NRF2 解离和NRF2核转位(图8)。






    7、MCL通过竞争性结合KEAP1的Arg483位点抑制巨噬细胞铁死亡并改善线粒体功能


    作者进一步研究了MCL是否抑制KEAP1-R483S突变巨噬细胞中的铁死亡,发现在KEAP1-R483S突变的巨噬细胞中,MCL不能改善ox-LDL诱导的细胞活力下降和LDH水平升高。此外,MCL对降低 KEAP1-R483S 突变巨噬细胞中总ROS和线粒体ROS的作用也消失,在巨噬细胞中转染 KEAP1-R483S减弱MCL对GPX4和xCT上调的影响。此外,MCL降低KEAP1-WT巨噬细胞中的铁含量和脂质ROS水平,但这种作用在KEAP1-R483S突变巨噬细胞中被消除,在 KEAP1-R483S 突变的巨噬细胞中,MCL对线粒体损伤的保护作用被抑制(图9)。


    此外,MCL不能改善ox-LDL 诱导的KEAP1-R483S突变巨噬细胞中细胞膜电位的丧失。KEAP1-R483S质粒转染减轻了MCL对线粒体功能的保护作用,氧消耗分析也显示MCL不能增加被KEAP1-R483S质粒感染的巨噬细胞的OCR。这些结果表明MCL通过竞争性地与KEAP1的Arg483位点结合来抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞铁死亡(图10)。




    8、携带 AAV-KEAP1-R483S 的ApoE ?/?小鼠中MCL的 AS保护作用减弱


    为了进一步证实MCL通过竞争性结合KEAP1的Arg483对AS的保护作用,将含有 KEAP1-WT和KEAP1-R483S的AAV通过尾静脉注射到8周龄ApoE ?/?小鼠体内,发现在 KEAP1-R483S突变小鼠中,MCL的抗炎作用、改善脂质沉积作用、提升GPX4,xCT和NRF2表达的作用均受到抑制。这些结果表明MCL通过竞争性结合KEAP1的Arg483位点来抑制巨噬细胞铁死亡和AS进展


    总结


    研究首次报道了MCL对AS的保护作用,阐明了MCL抑制AS的具体机制。MCL通过改善氧化应激抑制巨噬细胞铁死亡来抑制动脉粥样硬化,机制上通过竞争性结合KEAP1的Arg483位点促进NRF2活化,研究结果为MCL在AS治疗中的机制提供了新的见解,并提供了一种通过与NRF2竞争性结合KEAP1的Arg483位点来抑制巨噬细胞铁死亡,从而限制斑块进展的治疗方法。
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