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【金秋计划】辣椒素预防酒精所致急性胃粘膜损伤的新靶点

城头变幻大王骑

2024/09/12

中药/天然药检测

过量饮酒会带来巨大的健康风险，酒精会对胃粘膜造成氧化损伤，随后引起胃肠功能障碍、慢性萎缩性胃炎，与胃癌的发生密切相关。天然产物是治疗重大疾病的药物或先导化合物的主要来源。辣椒素（Capsicum）是辣椒（Capsicum annuum L）的主要活性化合物和辣味成分的主要决定因素，已有研究表明辣椒素（CAP）对乙醇诱导的胃粘膜损伤具有显著的保护作用，但其作用是否是通过CAP的抗氧化活性以及相关作用靶点尚不清楚。KEAP1-NRF2-ARE轴是最重要的抗氧化系统。然而，现有的小分子抑制剂都与KEAP1共价结合，这意味着一旦结合，它们不易解离，而持续抑制KEAP1则表现出严重的副作用，越来越多的研究人员专注于开发与KEAP1的非共价结合剂。

1、辣椒素激活NRF2/ARE信号通路保护人胃黏膜上皮细胞免受氧化应激

作者首先评估了辣椒素对GES-1氧化应激的保护作用。在乙醇（EtOH）处理的人胃黏膜上皮（GES-1）细胞中建立了氧化应激模型，发现辣椒素预处理改善EtOH导致的细胞活力降低，逆转EtOH组导致的细胞形态改变，降低EtOH导致的ROS水平升高，上调SOD水平，降低MDA的产生。这些结果表明，CAP有效地减弱了暴露于EtOH的GES-1细胞中的ROS水平并调节了氧化还原平衡。进一步作者通过蛋白质组学分析以鉴定差异表达蛋白，GO分析显示“抗氧化活性”“氧化还原酶活性”条目显著富集，此外，关键的抗氧化相关蛋白（GSS、SOD1、TXN）的表达显著升高，这些蛋白与抗氧化反应元件（ARE）相关，并作为转录因子NRF2的下游靶标发挥作用，结果表明CAP可能会激活氧化应激模型中的NRF2-ARE信号通路。进一步采用乙醇处理的GES-1细胞和过氧化氢（H2O2）处理的人脐带间充质干细胞（UC-MSC）的氧化应激模型，均显示CAP预处理同样提高了NRF2及其下游基因 TXN、HMOX1和NQO1的转录和蛋白质表达水平。

2、辣椒素促进NRF2转位到细胞核中，并抑制NRF2的降解，保护线粒体功能

作者接着研究CAP预处理对NRF2的影响，免疫荧光以及核质分离后开展WB均证实发现CAP有效地促进了NRF2向细胞核的易位。进一步研究发现CAP可抑制NRF2会发生蛋白酶体降解，起到类似蛋白酶体抑制剂PS-341相同的效果。线粒体是 ROS的主要细胞内来源，作者发现，EtOH处理后破坏线粒体完整性，而CAP预处理保留了GES-1细胞中线粒体的结构完整性，改善EtOH导致的线粒体膜电位降低，稳定了细胞内ATP水平，降低乳酸以及PKM2、LDHA的转录水平，表明从糖酵解到氧化磷酸化的潜在代谢重编程。

3、CAP破坏KEAP1-NRF2相互作用

为了探索CAP是否通过KEAP1调节NRF2，作者发现KEAP1表达在转录和蛋白质水平上都没有显著改变。鉴于CAP对KEAP1表达没有影响，表明CAP可能会破坏KEAP1和NRF2之间的相互作用。作者采用SPR和CO-IP均显示发现，KEAP1与NRF2体外直接结合，而CAP的添加减弱这种结合，结果表明CAP有效地损害了KEAP1-NRF2的互作。为了确定KEAP1 是否作为 CAP 介导的抗氧化特性的关键靶标，作者敲除KEAP1后发现，CAP显著激活野生型细胞中的NRF2和HO-1，导致细胞活力显著增加，而在KEAP1-KO细胞中CAP激活NRF2和HO-1的能力降低，结果表明KEAP1作为CAP赋予的抗氧化作用的关键介质，并在KEAP1-NRF2-ARE信号通路中起关键作用。

4、辣椒素直接与KEAP1相互作用

接着作者研究了KEAP1和CAP之间的相互作用。通过CETSA证实了两者的直接结合，通过分子对接和分子动力学模拟发现KEAP1表面口袋内可能的CAP相互作用残基的位置，特别是负责与NRF2互作的Kelch结构域，模拟结果证实了CAP可以作为蛋白质-蛋白质界面抑制剂发挥作用。鉴于已知大多数先前鉴定的KEAP1抑制剂是通过对KEAP1的半胱氨酸残基进行共价修饰，从而破坏 KEAP1-Cul3 和 KEAP1-NRF2 之间的相互作用，从而激活下游 NRF2-ARE 信号通路，作者通过质谱鉴定发现尽管CAP直接与KEAP1结合，但它并不是通过共价相互作用实现。

5、CAP在变构位点结合KEAP1

根据分子对接和动态模拟结果，作者纯化了野生型Kelch蛋白结构域（WT）和8种突变型（Mut），包括Y334A、R380A、N382A等，据报道，这些残基与NRF2和经典Keap1抑制剂结合。BLI和Pulldown实验发现KEAP1 上的CAP结合口袋和NRF2结合界面可能彼此不同，这意味着CAP是KEAP1的变构调节剂。为了探索CAP对Kelch结构域进行变构调节的潜在机制，作者进行了HDX-MS测定，发现CAP的加入导致Keap1的构象发生了变化，因此CAP可能通过变构调节削弱了KEAP1和NRF2之间的相互作用。

6、IR-HSA@CAP的制备和表征

作者进一步开发了一种方便的纳米药物递送平台用于在体内有效利用CAP。利用人血清白蛋白（HSA）、IRDye800成功配制了CAP封装的IRDye800-HSA纳米颗粒（IR-HSA@CAP），成功进行结构表征后，发现该纳米颗粒毒性低，且能够被细胞迅速内化，在胃环境中显著实现CAP的快速释放。在给药后的不同时间间隔进行成像显示CAP主要通过胃肠道处理，在胃内表现出明显的定位。

7、IR-HSA@CAP NPs激活体内Nrf2/ARE信号通路改善胃粘膜损伤

接着体内评估了该纳米颗粒对体内Nrf2/ARE信号通路的影响。发现该纳米颗粒不会对胃组织造成明显损害，而暴露于EtOH的胃组织中，明显的出血和糜烂明显。纳米颗粒显著改善胃粘膜溃疡损伤（UI）指数，使用 H&E染色和Masuda评分系统量化了病理损伤的程度，发现CAP治疗显著降低病理损伤指数。此外，IR-HSA@CAP纳米颗粒的治疗效果超过了单独施用的CAP。还有，CAP或IR-HSA@CAP纳米颗粒进行预处理可显著减少ROS的产生，降低脂质过氧化水平，提高了细胞内HMOX1和NQO1基因的表达水平。

图片

图7 IR-HSA@CAP NPs激活体内Nrf2/ARE信号通路改善胃粘膜损伤

进一步免疫组化和蛋白质印迹分析均显示IR-HSA@CAP预处理导致Nrf2，以及HO-1和Trx表达显著上调，这些结果表明,IR-HSA@CAP能够协调Nrf2/信号轴,从而为氧化应激和稳态平衡提供快速有效的调节机制。接着作者研究了IR-HSA@CAP的抗炎潜力，发现IR-HSA@CAP预处理可显著抑制促炎细胞因子的表达水平，增强抗炎细胞因子IL-10的表达。最后，作者证明了IR-HSA@CAP纳米颗粒在体内的高生物安全性。

总结

研究在体外和体内建立了乙醇诱导的急性氧化损伤模型，验证了CAP预处理对KEAP1-NRF2-ARE信号级联的影响，发现CAP的治疗效果，并通过BLI、CETSA、Pull-down、Co-IP和HDX-MS分析，发现CAP可以直接与KEAP1结合并抑制KEAP1与NRF2之间的相互作用，且该结合为变构结合。机制上，CAP 改善了线粒体损伤，促进了NRF2的核易位，从而促进了下游抗氧化反应元件HO-1、Trx、GSS和NQO1在GES1细胞中的表达。研究结果表明CAP是一种安全且新颖的NRF2激动剂，通过变构调节KEAP1，这可能有助于开发用于氧化应激相关疾病（例如衰老，癌症，神经退行性和心血管疾病）的先导药物。

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