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高效液相色谱|酸碱平衡的小知识
p3203140
2024/09/13
私聊
液相色谱(LC)
高效
液相色谱
(HPLC)中的酸碱平衡是指在色谱分析过程中,通过调节流动相的pH值来控制可离子化化合物的电荷状态,进而影响这些化合物在色谱柱上的保留行为和分离选择性。
较低的疏水性(较高的极性)会缩短中性样品在 RPC中的保留时间。离子化(例如使中性物质带有电荷)会显著提高酸或碱的极性或亲水性,从而导致该物质在 RPC 中的保留因子 k 降低 90% 甚至更多:
疏水性(在 RPC 的保留程度更高),亲水性(在 RPC 的保留程度较低)
图1中是保留时间与 pH 以及样品离子化程度之间的函数关系,并以模拟分离羧酸 HA( 图1的实线)和脂肪胶 B( 图1的虚线)的混合物为例予以说明。K 值随着离子化的程度增加而减小,当 pH=pKa (或[ H
+
]=Ka)时,化合物的离子化比例为 50%。(蛋白的pI值在pKa附近易产生沉淀)
图1.保留时间与 pH 以及样品离子化程度之间的函数关系
图2是不同pH条件下分离酸 HA 和碱 B 的过程,
当 pH 从4上升到10的时候,酸 HA( 阴影峰)离子化的程度更高,从而使保留时间缩短,与此同时,碱 B 因 pH 提高而减少离子化,延长了保留时间(在 pH=7 时,每个峰的 k 值均为 0.1)。从此例子可以看出,在分离含有酸和(或)碱样品的时候,改变流动相的 pH 可以很有效地控制分析物的保留时间(选择性)。
图2.分离酸 HA 和碱 B 的过程中,保留时间对应流动相 pH 的函数
01.高效
液相色谱
中酸碱平衡主要应用于哪几个方法?
1)
反相色谱(Reverse Phase Chromatography, RPC):这是最常用的HPLC模式,通常使用C18或C8色谱柱。在RPC中,通过调节流动相的pH值,可以改变可离子化样品组分的电荷状态,进而影响其在色谱柱上的保留行为。
2)离子交换色谱(Ion Exchange Chromatography, IEC):在IEC中,样品组分根据其电荷与固定相上的电荷相互作用而分离。调节流动相的pH可以改变样品组分的电荷状态,从而影响其与固定相的相互作用强度。
3)亲水作用色谱(Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography, HILIC):在HILIC中,极性样品在水富集的固定相上保留,而非极性溶剂作为流动相。调节流动相的组成和pH可以影响极性样品的保留和分离。
02.
调节流动相pH分离几种酸性混合物或碱性混合物的示例
图 3a 表示的以保留时间对流动相 pH 作图,分离的混合物中含有五种溶质:组分 1 为水杨酸(一种酸性较强的羧酸),组分 2 是苯巴比妥(一种弱酸),组分 3 是非那西汀(在此 pH 范围内为中性),组分 4 是烟碱(一种弱碱),组分 5 是甲基苯丙胶(一种强碱)。图3(b~e) 表示的是不同 pH 所对应的色谱流出图。值得注意的是,强碱性的组分别打阴影的峰)保留时间的相对(和完全)变化;当 pH增加时,组分 5 的离子化程度会减小,保留时间延长。
图3.RPC 流动相 pH 与不同类型溶质保留时间之间的函数关系。组分1 为水杨酸,组分 2 是苯巴比妥,组分3 是非那西汀,组分 4 烟碱和组分 5 为甲基苯丙胶(阴影峰)
03.
调节流动相的 pH 可以优化色 谱的选择性和分离度,如果分离的重现性较差,是pH的选择不当么?
答:
调节流动相的pH是优化HPLC中色谱选择性和分离度的重要手段,特别是当分离重现性较差时,可能是由于pH选择不当造成的。可以通过以下的手段进行改善:
1)
了解样品的pKa值:
选择流动相pH值时,应先了解被分析物的pKa值。调节流动相的pH值高于或低于pKa两个单位,有助于获得好的、尖锐的峰,因为这时化合物中99%以一种形式存在。
2)
缓冲液的选择:
缓冲液的选择应基于其pKa值与流动相pH的匹配度、溶解度和紫外吸收特性。缓冲液的pKa值与流动相pH相等时,缓冲能力最大,相差越大,缓冲能力越差。
3)
pH对峰型的影响:
当流动相pH与化合物的pKa接近时,可能会导致分子与离子形式共存,从而影响峰型。建议将pH控制在化合物的pKa±2的范围以外,以获得更尖锐的峰。
4)
pH对选择性的影响:
流动相pH值的微小变化对分离的选择性有显著影响,尤其是当pH接近pKa值时。在这种情况下,即使是0.1个pH单位的变化也可能导致分辨率的显著变化。
5)
pH的精确控制:
在实验室中,为了获得良好的分离重现性,需要对流动相pH进行精确控制,通常建议控制在±0.1个单位以内。
04.如何确定样品的pKa值以选择合适的pH范围进行色谱分离?
答:
1)
文献查询:
对于已知化合物,可以通过查阅文献或数据库获取pKa值。
2)
化学结构预测:
如果无法在数据库中找到相关信息,可以根据化合物的结构和已知类似化合物的pKa值进行预测。例如,常见的脂肪族羧酸pKa值约为5,胺类化合物的pKa值约为9 。
3)
电位滴定法:
这是一种常用的实验方法,通过记录一定温度下,累积加入碱的体积和每加入一定体积的碱后所测得的溶液pH值,然后通过作图得到物质的pKa值。
4)
分光光度法:
基于物质的分子状态和离子状态对某一波长光的吸收度不同,通过测量一系列不同pH值溶液的吸光度数据,可以计算得到pKa值 。
总结一下:
根据化合物的pKa值选择流动相的pH范围,通常建议
将pH控制在化合物的pKa±2的范围以外
,以确保化合物99%以分子或离子形式存在,从而获得更尖锐的色谱峰 。同时,
为了更好地控制保留行为的重现性,需要控制缓冲液的pH在±0.1个单位以内
。
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