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基于谷胱甘肽/谷胱甘肽过氧化物酶4轴探讨雷公藤甲素引起肝细胞铁死亡的作用机制

城头变幻大王骑

2024/09/13

中药/天然药检测

雷公藤作为传统中药，具有清热解毒、祛风通络、舒筋活血、消肿止痛、杀虫止血等作用，临床上对于类风湿性关节炎、肾病综合征、系统性红斑狼疮及自身免疫性肝炎等疾病具有独特疗效，然而其严重的肝脏毒性制约了临床应用[1]。作为一种环氧二萜内酯类化合物，雷公藤甲素是雷公藤的主要药理活性成分之一，亦是引起肝脏毒性反应的主要物质基础[2]。雷公藤甲素可导致斑马鱼、小鼠及大鼠肝细胞水样变性、核萎缩，肝组织结构紊乱，出现灶状坏死、炎性细胞浸润、血清转氨酶活性升高、胆汁淤积等症状[3]。体外条件下，雷公藤甲素可降低肝巨噬细胞、肝癌细胞和正常肝细胞活力，引起肝细胞死亡[4-5]。研究表明，雷公藤甲素导致肝损伤主要涉及氧化应激、细胞色素P450超家族代谢异常、细胞凋亡、细胞自噬、免疫稳态失衡、肠道菌群失调等多种机制[6]。
铁死亡是一种新型调节性细胞死亡形式，其特征是铁依赖性的脂质过氧化引发的细胞膜氧化损伤，主要表现为细胞膜外膜起泡破裂、线粒体膜密度增加、嵴密度减少或消失等[7]。铁死亡参与了多种疾病的病理发生过程，如肿瘤、神经退行性疾病、急性肾衰竭、心脏缺血再灌注等[8]。多种药物引起的肝毒性也与其干扰铁离子代谢过程导致铁死亡密切相关。解热镇痛药对乙酰氨基酚可减低体外培养原代小鼠肝细胞中抗氧化物谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量，抑制谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）表达，而铁死亡抑制剂（ferrostatin-1，Fer-1）则能够明显降低对乙酰氨基酚的肝细胞毒性作用，提高细胞存活率[9]；体内条件下，Fer-1可改善小鼠肝组织中铁代谢紊乱，抑制铁死亡相关基因长链脂酰辅酶A合成酶4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4）和前列腺素内过氧化物合成酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）的高表达，减轻对乙酰氨基酚引起的小鼠肝组织损伤[10]。川楝素在激活蛋白激酶R样内质网激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）-真核起始因子2α亚基（eukaryotic initiation factor 2α subunit，eIF2α）-激活转录因子4（activation transcription factor 4，ATF4）信号通路，引起ATF3介导的转铁蛋白受体1（transferrin receptor 1，TFR1）表达上调的同时，可明显抑制铁输出蛋白溶质载体家族40成员1（solute carrier family 40 member 1，SLC40A1）的表达，导致肝细胞内铁超载，并通过下调GPX4的表达，引起肝细胞铁死亡[11]。雷公藤甲素可呈剂量相关性地引起铁离子聚集，导致大鼠肝组织损伤，表明铁死亡可能是雷公藤甲素导致肝损伤的关键机制[12]。然而，目前对于雷公藤甲素调节肝细胞铁死亡的作用途径及铁死亡在雷公藤甲素肝毒性中的功能仍有待阐明。

本研究拟在体外和体内条件下观察雷公藤甲素对肝细胞铁代谢和脂质过氧化的影响，探讨雷公藤甲素对铁死亡的调控途径，以期为揭示雷公藤甲素肝毒性的作用机制，寻找抑制雷公藤甲素肝毒性的作用靶点提供线索。
1 材料
1.1 细胞及动物
人源正常肝细胞HL7702购自北纳创联生物技术有限公司。SPF级雄性C57BL/6J小鼠，体质量16～18 g，6周龄，购自北京斯贝福生物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2019-0010。小鼠饲养于山西中医药大学SPF级动物房，饲养温度20～25 ℃，相对湿度55%～65%，自由进食饮水，适应性喂养7 d。动物实验经山西中医药大学动物伦理委员会批准（批准号2021DW207）。
1.2 药品与试剂
雷公藤甲素（质量分数＞98%，批号230903）购自上海融禾医药科技发展有限公司；铁死亡抑制剂Fer-1（批号149105）购自美国MedChemExpress公司；RPMI 1640完全培养基（批号2305002）、PBS稀释液（批号20230517JH）、胰酶（批号2305002）、普鲁士蓝染色试剂盒（批号20220316）、BCA蛋白浓度试剂盒（批号2307001）购自北京索莱宝科技有限公司；CCK-8试剂盒（批号MA0218-2-Mar-29H）、飞克特超敏ECL发光液（批号MA0186-Apr-041）购自大连美仑生物技术有限公司；铁离子含量检测试剂盒（批号20220321）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒（批号20231020）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒（批号20231018）、GSH检测试剂盒（批号20231016）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）检测试剂盒（批号C009-2-1）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）试剂盒（批号C010-2-1）购自南京建成生物工程研究所；胎牛血清（批号J825FC0251）、Trizol试剂（批号G921KA7072）、HRP标记的山羊抗兔二抗（批号J804AA0007）购自上海生工生物工程公司；MonScriptTM RTIII AII-in-One Mix试剂盒（批号140713）、MonAmpTM ChemoHS qPCR Mix试剂盒（批号00007547-110721）均购自莫纳生物科技有限公司；GPX4抗体（批号10026631）、ACSL4抗体（批号00108861）、PTGS2抗体（批号00104008）均购自武汉三鹰生物技术有限公司；TFR1抗体（AF8136）、蛋白酶抑制剂（批号CR2303056）、RIPA蛋白裂解液（批号011921210824）、HRP标记的山羊抗小鼠二抗（批号090523231228）购自上海碧云天生物技术有限公司；β-actin抗体（批号AC220227004）购自武汉赛维尔生物科技有限公司。
1.3 仪器
Galaxy 170s型CO2培养箱（德国Eppendorf公司）；Multiskan FC型酶标仪（美国Thermo公司）；QuickDrop微量紫外分光光度计（美国Molecular Devices公司）；Powercycler 普通PCR仪（英国Analylik Jena公司）；Archimed X4型实时荧光定量PCR仪（北京鲲鹏基因科技有限责任公司）；ImageQuant LAS 500型化学发光成像系统（美国GE公司）；Allegra X-30R型台式冷冻离心机（美国Beckman Coulter公司）；DYCZ-24DN型电泳槽、DYCZ-40DN型转印槽、DYY-7C型电泳仪（北京六一生物科技有限公司）。
2 方法
2.1 细胞培养
HL7702细胞用含10%胎牛血清、100 μg/mL链霉素和100 U/mL青霉素的RPMI 1640培养基，于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。
2.2 细胞实验分组和处理
取对数生长期的HL7702细胞，以1.5×105个/孔接种于96孔板或以3×106个/mL接种于6孔板中，加入25、50、100 nmol/L的雷公藤甲素，处理细胞24 h，或者加入50 nmol/L雷公藤甲素处理12、24、48 h，同时设置对照组（加入不含药物的培养基），采用CCK-8法检测细胞存活率，利用铁离子含量检测试剂盒测定铁离子含量，普鲁士蓝染色观察铁沉积情况，qRT-PCR检测TFR1、PTGS2和ACSL4 mRNA表达，Western blotting检测TFR1、GPX4、PTGS2和ACSL4蛋白表达，试剂盒检测GSH、MDA含量和SOD活性。
取对数生长期的HL7702细胞，以1.5×105个/孔接种于96孔板或以3×106个/mL接种于6孔板中，设置对照组（加入不含药物的培养基）、雷公藤甲素组、Fer-1组、雷公藤甲素＋Fer-1组，用Fer-1（2 μmol/L）预处理细胞24 h后，再用50 nmol/L的雷公藤甲素处理细胞24 h。采用CCK-8法检测细胞存活率，利用铁离子含量检测试剂盒测定铁离子含量，Western blotting检测TFR1、GPX4、PTGS2和ACSL4蛋白表达。
2.3 CCK-8检测细胞存活率
为了观察雷公藤甲素不同浓度和不同处理时间对细胞存活率的影响，按“2.2”项下方法处理细胞，按照CCK-8试剂盒说明书测定各孔吸光度（A）值，并计算细胞存活率。
细胞存活率＝(A给药－A空白)/(A对照－A空白)
2.4 普鲁士蓝染色观察铁沉积情况
按“2.2”项下方法处理细胞，经4%多聚甲醛固定后，用Perls染色液染色30 min，充分冲洗，再用伊红染色液染色15 s，封片，光学显微镜下观察铁沉积。参照文献方法[13]用Image J软件分析普鲁士蓝染色蓝色区域面积占总面积的百分比。
2.5 铁离子、GSH、MDA含量及SOD活性测定
按“2.2”项下方法处理细胞，按照试剂盒说明书分别测定铁离子、GSH、MDA含量和SOD活性。
2.6 qRT-PCR检测TFR1、PTGS2和ACSL4 mRNA表达
按“2.2”项下方法处理细胞，按照试剂盒说明书提取细胞总RNA并合成cDNA，进行qRT-PCR分析。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列见表1。
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2.7 Western blotting检测TFR1、GPX4、PTGS2和ACSL4蛋白表达。
按“2.2”项下方法处理细胞，经PBS漂洗后，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，冰上裂解15 min后，23号针头反复吹打破碎细胞，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液，BCA法测定蛋白浓度。将上清液与SDS上样缓冲液混匀，95 ℃加热5 min使蛋白变性。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，加入含5%脱脂奶粉的TBST，室温封闭1 h，按照1∶1 000的稀释比例分别加入TFR1、GPX4、PTGS2、ACSL4及β-actin一抗，4 ℃孵育过夜后，加入二抗（1∶5 000）室温孵育1 h。采用ECL化学发光试剂盒在化学发光成像系统下进行曝光，以β-actin为内参，Image J软件定量目的条带。
2.8 动物实验分组、给药及指标检测
C57BL/6J小鼠随机分为对照组和雷公藤甲素（0.8 mg/kg）[2,14]组，每组10只，雷公藤甲素组ip雷公藤甲素，对照组ip等体积的生理盐水，每隔2天注射1次，连续注射3次，末次给药24 h后，眼眶取血，分离血清，按照试剂盒说明书检测血清中ALT、AST、SOD活性和铁离子、GSH、MDA含量。取相同部位的肝脏，于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋，切片经脱蜡、苏木素-伊红（HE）染色，光学显微镜下观察肝组织形态变化。qRT-PCR检测肝组织TFR1、PTGS2和ACSL4 mRNA表达，Western blotting检测肝组织TFR1、GPX4、PTGS2和ACSL4蛋白表达。
2.9 统计学分析
数据通过GraphPad Prism 8.0软件分析并作图，以表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。
3 结果
3.1 雷公藤甲素抑制HL7702细胞存活率
HL7702细胞经25、50、100 nmol/L的雷公藤甲素处理24 h后，随着给药浓度升高，细胞存活率逐渐下降（P＜0.05，图1-A）。HL7702细胞经50 nmol/L雷公藤甲素处理12、24、48 h后，细胞存活率随着给药时间延长逐渐降低（P＜0.05，图1-B）。
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3.2 雷公藤甲素引起HL7702细胞铁超载
铁代谢紊乱是铁死亡发生的必要条件[15]。TFR1作为铁代谢过程中关键的细胞表面受体，通过内吞作用负责铁离子的摄取[16]。HL7702细胞经不同浓度雷公藤甲素处理24 h后，随着给药浓度升高，细胞内铁离子含量逐渐增加（P＜0.05，图2-A），并且对照组未观察到明显的铁沉积，而雷公藤甲素可使铁沉积面积明显增加（图2-B）。此外，qRT-PCR和Western blotting检测结果显示，随着雷公藤甲素给药浓度升高，TFR1 mRNA和蛋白表达量较对照组显著增加（P＜0.05，图2-C、D）。
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3.3 雷公藤甲素引起HL7702细胞中脂质过氧化损伤
脂质过氧化损伤作为铁死亡的主要特征之一，是铁死亡检测的重要指标。GSH和SOD是体内关键的抗氧化剂，MDA作为脂质过氧化的副产物，可以间接反映过氧化损伤程度[8]。HL7702细胞经不同浓度雷公藤甲素处理24 h后，雷公藤甲素可显著降低GSH的含量，抑制SOD活性，提高MDA含量，且呈现浓度相关性（P＜0.05，图3）。
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3.4 雷公藤甲素对HL7702细胞中铁死亡相关蛋白表达的影响
GPX4是构成应对脂质过氧化防御系统的关键抗氧化酶[8]；PTGS2和ACSL4被认为是铁死亡的生物标志物。PTGS2负责将花生四烯酸代谢为前列腺素，细胞发生铁死亡时PTGS2表达明显上调[17]。ACSL4是铁死亡的关键调控因子，可激活花生四烯酸和肾上腺素等多不饱和脂肪酸生成酰基辅酶A，后者进入质膜磷脂中促使细胞发生铁死亡[18]。HL7702细胞经不同浓度雷公藤甲素处理24 h后，雷公藤甲素可显著抑制GPX4的表达（P＜0.05，图4-A），促进PTGS2和ACSL4表达（P＜0.05，图4-B、C）。
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3.5 Fer-1逆转雷公藤甲素引起的HL7702细胞铁死亡
为了观察Fer-1对雷公藤甲素肝细胞毒性的影响，采用雷公藤甲素与Fer-1共同处理HL7702细胞。结果显示，与雷公藤甲素组比较，Fer-1与雷公藤甲素联合处理组细胞存活率和GPX4表达量显著升高（P＜0.05，图5-A、C），铁离子含量、TFR1、PTGS2及ACSL4蛋白表达量显著降低（P＜0.05，图5-B、C）。
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3.6 雷公藤甲素引起小鼠肝组织铁死亡
课题组前期研究与本研究结果均表明，小鼠ip雷公藤甲素后，肝组织结构受损明显，细胞肿胀、坏死，局部可见炎症浸润，血清ALT、AST活性明显升高[2,14]（P＜0.05，图6-A、B）。体内观察雷公藤甲素对肝细胞铁死亡的影响，结果显示，与对照组比较，雷公藤甲素组GSH含量、SOD活性和GPX4表达量显著降低（P＜0.05，图6-C、F），铁离子、MDA含量及TFR1、PTGS2、ACSL4表达量显著升高（P＜0.05，图6-C～F）。
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4 讨论
本研究中，雷公藤甲素在降低肝细胞活性的同时，能够明显提高正常肝细胞和小鼠肝组织中的铁离子含量，引起铁代谢紊乱，导致铁超载，这可能与雷公藤甲素能够增加TFR1表达有关。TFR1的过量表达可促进铁离子向细胞内转运，大量的铁离子则通过芬顿反应产生羟基和氢过氧自由基等大量活性氧，驱动破坏性的过氧化链式反应[16]。本研究还观察到雷公藤甲素可明显降低肝细胞中GSH含量，抑制SOD活性，下调GPX4表达量，提高脂质过氧化产物MDA含量，促进肝细胞铁死亡，导致铁死亡标记物ACSL4、PTGS2的表达明显升高。GPX4是一种清除脂质过氧化物的关键酶，在GSH存在的条件下，将其转化为氧化型谷胱甘肽并将有毒的脂质过氧化物还原为无毒的脂质醇以防止铁死亡的发生[19]。GPX4失活或表达量下调可诱导铁死亡，常作为铁死亡的参考标记物[20]。Fer-1作为人工合成的自由基捕获剂，可有效清除自由基，抑制脂质过氧化，阻断铁死亡[21]。体外条件下，Fer-1处理可以逆转雷公藤甲素引起的铁超载，减轻脂质过氧化，明显缓解雷公藤甲素引起的肝细胞铁死亡和细胞毒性。因此，雷公藤甲素可能通过GSH/GPX4轴干预铁代谢和脂质过氧化，引起肝细胞铁死亡，导致细胞活性降低。Fer-1则通过下调TFR1和上调GPX4表达抑制铁死亡。然而，本研究仅在体外条件下观察了Fer-1对雷公藤甲素肝细胞毒性的改善作用，今后将尝试利用多种动物模型和包括Fer-1在内的不同类型铁死亡调节剂，如RSL3、索拉非尼、Liproxstatin-1、去铁胺等[22]，进一步验证铁死亡对雷公藤甲素肝毒性的调控效应和作用途径。
铁死亡存在高度复杂和精细的调控网络，多种信号通路直接或间接影响铁代谢或脂质过氧化影响铁死亡过程，参与雷公藤甲素药理作用[6]。溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）作为多通道跨膜蛋白负责将细胞外的胱氨酸和细胞内的谷氨酸等比例输入或输出，输入的胱氨酸随即被还原成半胱氨酸，用于GSH的合成。雷公藤甲素一方面可通过干预心肌细胞铁离子代谢，导致细胞内铁超载，并抑制抗氧化系统，导致细胞内活性氧累积；另一方面，雷公藤甲素直接结合SLC7A11，导致GSH耗竭，从而抑制SLC7A11/GPX4信号轴，最终引起脂质过氧化物MDA水平升高，触发心肌细胞铁死亡[23]。雷公藤甲素可抑制体内抗氧化反应的主要调节因子核因子E2相关因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）的表达，上调活性氧和脂质过氧化水平，降低GPX4表达，从而促进白血病细胞铁死亡，克服对阿霉素的耐药性[24]。另外，雷公藤甲素还可同时抑制Nrf2和SLC7A11表达，引起活性氧聚集和铁离子超载，与铁死亡促进剂Erastin共用协同促进头颈部肿瘤细胞铁死亡[25]。纳米材料包裹的雷公藤甲素可通过抑制Nrf2表达，导致活性氧累积和GSH耗竭，促进脂质过氧化，引起黑色素瘤细胞、乳腺癌细胞铁死亡[26-27]。后续工作将探讨上述分子机制或信号通路是否在雷公藤甲素引起肝细胞铁死亡过程中发挥作用。
全基因组芯片分析结果显示，雷公藤甲素可明显改变氧化应激途径中多种关键基因表达，表明氧化应激与雷公藤甲素药理作用密切相关[28]。除了肝毒性和心脏毒性外[23]，氧化应激也是雷公藤甲素导致其他多种器官毒性的关键机制。雷公藤甲素能够降低大鼠肾脏中抗氧化酶活性，引起体内活性氧累积和脂质过氧化物MDA含量异常升高，诱发肾脏氧化应激损伤[29]。雷公藤甲素可引起卵母细胞线粒体功能障碍，导致活性氧过度累积，降低抗氧化酶活性，影响卵母细胞发育[30]。雷公藤甲素还可通过破坏雄性生殖系统氧化还原平衡，引起氧化应激，导致睾丸组织损伤[31]。另外，雷公藤甲素能够通过明显降低食管癌细胞Nrf2的表达，抑制其进入细胞核与抗氧化反应元件的结合，改变细胞氧化应激水平，促进细胞凋亡[32]。雷公藤甲素可升高鼻咽癌细胞中活性氧水平，诱导氧化应激，从而抑制蛋白激酶B的表达与活化，抑制细胞生长[33]。由于氧化应激引起的脂质过氧化是引起铁死亡的关键机制，未来有必要观察在上述病理生理条件下氧化应激能否引起铁死亡，以及铁死亡是否在上述药理作用中发挥相似作用。
综上，本研究观察了雷公藤甲素对正常肝细胞和小鼠肝组织中铁死亡途径相关指标的影响，结果验证了雷公藤甲素可能通过GSH/GPX4轴引起铁代谢异常和脂质过氧化，诱导肝细胞铁死亡，抑制铁死亡则可在体外条件下有效缓解肝细胞毒性，为揭示雷公藤甲素肝毒性的作用机制及铁死亡作为抑制雷公藤甲素肝毒性的潜在靶点提供了依据。

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