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基于网络药理学和铁死亡探讨牡荆苷改善心肌缺血再灌注损伤的潜在作用机制

城头变幻大王骑

2024/09/13

中药/天然药检测

随着社会老龄化加剧，心血管疾病发病率持续上升且呈年轻化趋势。心肌缺血再灌注损伤是急性心梗采取再灌注治疗后引起的一系列心肌损伤[1]，包括心肌代谢紊乱、心梗面积增加等，其机制与细胞凋亡、氧化应激、自噬、炎症反应、内质网应激等生理变化密切相关[2-3]，涉及多个信号通路，死亡率较高。目前尚无有效手段来治疗和预防心肌缺血再灌注损伤，从中药中筛选安全有效预防和改善心肌缺血再灌注损伤药物的手段已成为研究前沿。

牡荆苷是一种广泛存在于药用植物中的C-糖基化黄酮类化合物，具有降糖、调脂、抗炎、抗癌及改善氧化应激类疾病等活性[4-5]，是竹叶中的典型成分之一。目前有研究表明，牡荆苷对心肌缺血再灌注损伤有明显改善作用[6-8]，具有开发为心肌保护及预防心肌缺血再灌注损伤药物的潜力，但是其分子机制尚未明确。网络药理学结合系统生物学、药理学、生物信息学等理论，为揭示天然产物多靶点、多通路的作用机制提供了可靠的研究方法[9-11]。分子对接技术可以对化合物与靶标的结合模式和结合亲和力进行模拟分析，广泛应用于药物作用机理解析和新药设计领域[12-14]。本研究采用网络药理学和分子对接技术对牡荆苷改善心肌缺血再灌注损伤的潜在分子机制进行研究，旨在为设计牡荆苷作为治疗心肌缺血再灌注损伤等心血管疾病药物提供科学依据和理论支撑。

1 材料与方法
1.1 牡荆苷的潜在靶点筛选
通过PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih. gov/）数据库得到牡荆苷的3D结构和SMILES格式文件，利用Chem3D 20.0对牡荆苷的3D结构进行能量最小化。综合利用TCMSP[15]（https://old. tcmsp-e.com/tcmsp.php）、Pharm Mapper[16-19]（http:// www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）、SEA[20]（https:// sea.bkslab.org/）、Super-Pred[21]（https://prediction. charite.de/index.php）、CTD[22]（https://ctdbase.org/）、SYMMAP[23]（http://www.symmap.org/）、SwissTarget Prediction[24-25]（http://www.swisstargetprediction.ch/）数据库对牡荆苷进行靶点预测和搜集，所有数据库参数均选择默认选项，生成牡荆苷预测靶点信息，将所得靶点信息进行合并去重，得到牡荆苷的潜在活性靶点。
1.2 牡荆苷与心肌缺血再灌注损伤交集靶点筛选
使用“myocardial ischemia reperfusion injury”作为检索条件，利用GeneCards数据库[26]（https:// www.genecards.org/）和OMIM数据库[27]（https:// www.omim.org/）获得心肌缺血再灌注损伤的相关作用靶点，合并去重处理后利用Venny在线工具（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）与牡荆苷靶点取交集，即为牡荆苷改善心肌缺血再灌注损伤的潜在靶点。
1.3 交集靶点蛋白相互作用（PPI）网络的构建
STRING（https://cn.string-db.org/）是一个在线生物数据库，可以预测PPI网络[28]。将牡荆苷和心肌缺血再灌注损伤的交集靶点导入STRING数据库，物种设置为“Homo sapiens”，置信水平设置为0.400来获得所需的最小交互分值。通过Cytoscape 3.7.2对网络进行可视化，使用CytoNCA插件计算互作网络中的拓扑指数，包括中介中心性（BC）、接近中心性（CC）、度中心性（DC）、特征向量中心性（EC）、基于局部平均连接度的方法（LAC）和网络中心性（NC），以各拓扑指数中位数作为阈值筛选关键靶点。使用MOCDE插件获得关键子网络，与关键靶点取交集得到核心靶点。
1.4 基因本体（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析
为了对交集靶点的功能和通路进行注释，使用DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/）功能标注模块进行GO与KEGG富集分析，P＜0.05的GO条目和KEGG通路被认为显著富集。利用生物信息学在线平台（http://www.bioinformatics.com.cn/）绘制通路富集分析结果图。
1.5 “牡荆苷–靶点–通路”网络构建及拓扑性分析
利用Cytoscape 3.7.2对牡荆苷和心肌缺血再灌注损伤的交集靶点及其KEGG富集通路结果构建“牡荆苷–靶点–通路”网络，使用CytoNCA插件得到网络拓扑信息，以DC值为主要指标，BC、CC、EC为次要指标筛选牡荆苷改善心肌缺血再灌注损伤的关键核心靶点及关键核心通路。
1.6 牡荆苷调控铁死亡改善心肌缺血再灌注损伤的作用靶点
由1.3项下得到的核心靶点中10个靶点和铁死亡调控相关，为研究牡荆苷调控铁死亡改善心肌缺血再灌注损伤的机制，将牡荆苷预测靶点、心肌缺血再灌注损伤靶点、铁死亡靶点取共同交集靶点，其中铁死亡靶点基于FerrDb V2数据库[29]（http:// www.zhounan.org/ferrdb/current/）进行搜集。将交集靶点利用STRING数据库进行PPI分析，通过Cytoscape 3.7.2进行PPI网络构建，使用CytoHubaa插件筛选前5个靶点，即牡荆苷调控铁死亡改善心肌缺血再灌注损伤的关键核心靶点。
1.7 分子对接验证
将牡荆苷改善心肌缺血再灌注损伤的关键核心靶点和牡荆苷调控铁死亡改善心肌缺血再灌注损伤的关键核心靶点分别进行分子对接验证。通过RCSB PDB（https://www.rcsb.org/）数据库获取各靶点的蛋白结构文件，利用Maestro 13.5的“protein preparation workflow”工具对靶标蛋白进行去水、加氢等优化，利用”LigPrep”对牡荆苷的3D结构进行优化，力场均为”OPLS4”；通过”Receptor Grid Generation”模块进行对接盒子设置，利用Glide模块进行标准精度（SP）半柔性分子对接，以上参数均为默认设置。以“Glide Gscore”为得分函数值评价牡荆苷与各靶标蛋白的相互作用，其值越小表明对接复合物越稳定、结合作用越好，对接结果使用Maestro 13.5和PyMOL进行可视化分析。
2 结果
2.1 牡荆苷与心肌缺血再灌注损伤的交集靶点
基于TCMSP等7个数据库对牡荆苷潜在靶点的预测信息，经筛选共得到牡荆苷潜在活性靶点211个。利用GeneCards和OMIM数据库筛选获得心肌缺血再灌注损伤的相关作用靶点2 514个。对牡荆苷潜在靶点与心肌缺血再灌注损伤相关靶点取交集，共得到74个交集靶点，见图1，即牡荆苷改善心肌缺血再灌注损伤的潜在靶点。
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2.2 靶点PPI网络的构建与分析
利用STRING数据库对牡荆苷与心肌缺血再灌注损伤的交集靶点进行PPI分析，得到PPI网络。该网络由74个节点和635条边组成，表明交集靶点之间具有生物学相关性，其相互作用以蛋白质间的每条边表示。通过CytoNCA插件计算拓扑参数，根据条件（BC＞10.571 8、CC＞0.527 1、DC＞13、EC＞0.085 4、LAC＞9.242 9、NC＞10.667 1）共筛选得到29个靶点（图2A）；利用MCODE插件进行子网络分析，共得到4个子网络，其中关键子网络共23个靶点，由23个节点和223条边组成，得分为20.273，二者取交集绘制Venn图（图2B），最终得到包括肿瘤坏死因子（TNF）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、雌激素受体1（ESR1）等22个核心靶点（图2C），靶点具体信息见表1。
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2.3 GO、KEGG富集分析
将牡荆苷与心肌缺血再灌注损伤的交集靶点上传至DAVID数据库进行GO和KEGG富集分析，显著性水平设为P＜0.05。共得到1 451个GO富集条目结果，其中生物过程（BP）为1 286条，分子功能（MF）为78条，细胞组分（CC）为87条。分别以P值为指标进行筛选，选择BP、MF、CC排名前10位的条目，见图3。交集靶点主要参与对化学物质的反应、对内源刺激的反应、对含氧化合物的反应、细胞凋亡过程的调控等BP；主要发挥催化活性、酶结合、蛋白质结构域特异性结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性等MF。胞外区部分、囊泡、胞质部分、分泌颗粒等CC为交集靶点的反应区域。
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KEGG通路富集结果显示，共筛选得到相关通路77条，根据P值筛选前16个条目绘制水平条形图，见图4。同时基于前10个条目及关联基因绘制桑基气泡图，见图5。排名前10位的通路分别是脂质和动脉粥样硬化、流体剪切应力与动脉粥样硬化、癌症途径、白细胞介素（IL）-17信号通路、神经营养因子信号通路、细胞凋亡、肺结核、癌症中的蛋白聚糖，另外还有TNF信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路等通路均与心肌缺血再灌注损伤关联紧密[3, 30]。
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2.4 “牡荆苷–靶点–通路”网络及其拓扑性分析
对牡荆苷和心肌缺血再灌注损伤的交集靶点及其KEGG富集通路结果通过Cytoscape 3.7.2构建“牡荆苷–靶点–通路”网络（图6），该网络由71个节点和434条边组成。利用CytoNCA插件对“牡荆苷–靶点–通路”网络进行拓扑参数分析，结果显示MAPK10、TNF、非受体酪氨酸激酶（SRC）、细胞分裂周期因子42（CDC42）、Bcl-2为连接度最强的5个关键核心靶点，它们所在的癌症通路、流体剪切应力与动脉硬化通路、MAPK信号通路及癌症相关蛋白聚糖通路则是5条与牡荆苷作用密切相关的关键核心通路，见表2。
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2.5 牡荆苷调控铁死亡改善心肌缺血再灌注损伤的作用靶点
对2.2项下发现的核心靶点分析可以发现其中包括MAPK14、白蛋白（ALB）、红细胞衍生核因子2样蛋白2（NFE2L2）、血红素加氧酶1（HMOX1）等10个靶点均为铁死亡相关靶点，见表1，涉及铁死亡驱动靶点、抑制靶点、标记靶点等类型。
为进一步研究牡荆调控铁死亡改善心肌缺血再灌注损的作用机制，将牡荆苷预测靶点、心肌缺血再灌注损相关靶点及铁死亡靶点取交集，共得到16个交集靶点（图7A），通过STRING数据库进行PPI分析后利用Cytoscape 3.7.2绘制PPI网络图（图7B），应用CytoHubba插件获得了5个连接度最高的关键核心靶点，分别为NFE2L2、ALB、HMOX1、MAPK14、前列腺素内过氧化物合成酶2（PTGS2）。
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2.6 分子对接验证
为了进一步分析牡荆苷对“牡荆苷–靶点–通路”网络中的5个关键核心靶点及牡荆苷调控铁死亡改善心肌缺血再灌注损伤的5个关键核心靶点的结合模式和结合能力，利用Maestro 13.5的Glide模块对牡荆苷和上述10个靶点进行分子对接，获得对接结合能，见表3。当对接能量小于?1.2 kcal/mol（1 cal＝4.2 J）[31]，对接结果中所有靶点与牡荆苷对接分数均小于?1.2 kcal/mol，表明所有靶点都可以自发与牡荆苷结合，且结合亲和力较强，推测其在牡荆苷改善心肌缺血再灌注损伤的过程中发挥重要作用，具体分子对接模式见图8。
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3 讨论
随着中药现代化的大力推进，从传统中药中筛选具有临床价值的药物活性组分已成为研究热点。牡荆苷作为中药竹叶中典型的黄酮类化合物，因其优良的生物活性已被广泛应用于治疗心血管类疾病的研究中。Wan等[32]基于均匀设计（UD）和逐步回归（SR）建模的多目标优化算法，发现虎杖中牡荆苷、荭草苷及槲皮苷的优良组合可以通过提高细胞活力，降低乳酸脱氢酶（LDH）的泄漏率和一氧化氮（NO）的水平，对缺氧/复氧（H/R）诱导的H9c2细胞损伤产生显著的心脏保护作用。尽管牡荆苷的代谢途径可能会受到给药方式等多种因素的影响，但目前已有研究表明牡荆苷的体外及体内药理活性显著[6-7]，均对心肌缺血再灌注损伤有保护作用，因此阐明牡荆苷改善心肌缺血再灌注损伤的分子机制，对临床药物设计具有重要意义。
本研究基于网络药理学方法筛选了牡荆苷的潜在活性靶点，并与心肌缺血再灌注损伤相关靶点取交集得到74个共同靶点。通过STRING数据库对交集靶点进行了PPI分析，构建了PPI网络，根据网络拓扑参数筛选得到22个核心靶点。其中TNF和IL可抑制炎性细胞因子TNF-α和IL-1β的释放，通过Notch1介导的氧化/硝化应激抑制来降低心肌细胞凋亡等损伤[33]，同时作用TNF、SRC和Bcl-2可以抑制NF-κB诱导趋化因子和黏附分子并降低白细胞浸润及细胞凋亡，从而发挥改善心肌缺血再灌注损伤的作用[34]。富集分析结果表明，交集靶点主要参与化学物质反应、内源性刺激反应、氧化还原反应、细胞凋亡调控等BP，具有催化活性、蛋白激酶活性等MF，定位于胞外区、囊泡、分泌颗粒等CC，且主要参与脂质和动脉硬化通路、流体剪切应力与动脉硬化通路、癌症通路、IL-17通路和神经营养因子通路等信号通路。通过对“牡荆苷–靶点–通路”网络进行构建和分析，得到排名的前5位的关键核心靶点为MAPK10、TNF、SRC、CDC42、Bcl-2，排名前5位的通路有癌症通路、流体剪切应力与动脉硬化通路、MAPK信号通路、病原大肠杆菌感染通路以及癌症相关蛋白聚糖通路。以上靶点和通路与炎症、凋亡及增殖等多个生理过程相关，在网络拓扑学参数分析中显示出高度的连接中心性，提示牡荆苷保护心肌免受再灌注损伤的潜在机制与这些靶点和通路高度相关。
进一步对22个核心靶点进行分析，发现其中10个靶点参与铁死亡调控。铁死亡是一种铁依赖性的新型的细胞死亡方式，其本质是由于谷胱甘肽过氧化物酶（GPX4）活性下降，导致Fe2+介导的脂质过氧化产生脂质自由基，引发脂质过氧化链式反应，破坏细胞膜完整性，从而引发细胞死亡[35]。牡荆苷可通过调控铁死亡来改善相关疾病，Guo等[36]发现牡荆苷可通过Keap1/Nrf2/HO-1信号传导减轻氧化损伤和铁死亡来改善脑缺血再灌注损伤，Zhang Sheng等[37]研究表明牡荆苷通过抑制GPX4介导的铁死亡来改善糖尿病肾病。目前有研究表明铁死亡与心肌缺血再灌注损伤关联密切[38-41]，并被认为是治疗心肌缺血再灌注损伤的新靶点。对牡荆苷预测靶点、心肌缺血再灌注损伤相关靶点及铁死亡靶点取交集得到的16个靶点构建PPI网络，并筛选得到其中5个关键核心靶点NFE2L2、ALB、HMOX1、MAPK14、PTGS2，表明牡荆苷可以通过调控多个铁死亡相关靶点来改善心肌缺血再灌注损伤。
分子对接技术可以预测小分子化合物与蛋白靶标之间的结合模式和强弱，利用分子对接技术分别对牡荆苷与“牡荆苷–靶点–通路”网络中的关键核心靶点及其调控铁死亡改善心肌缺血再灌注损伤的关键靶点进行分析，结果表明MAPK10、TNF、SRC、CDC42、Bcl-2可与牡荆苷形成稳定复合物。其中MAPK10、TNF与牡荆苷的结合效果最好，结合能分别为?9.430 8、?8.714 0 kcal/mol，在空间匹配上牡荆苷母核和糖苷均可有效嵌入结合口袋来降低结合自由能。牡荆苷主要通过与MAPK10的Ser193、Ser72、Asn152及Met149等氨基酸残基产生氢键作用力；其C环与TNF的C链Tyr135产生π-π堆积，同时5号位羟基可与C链Tyr227等氨基酸残基产生氢键作用力。MAPK10属MAPK家族，参与细胞凋亡、增殖等过程，Ser193和Ser72位点的磷酸化对其激酶活性至关重要，Asn152和Met149位于ATP结合区，牡荆苷与之作用可能影响ATP的结合从而抑制MAPK10的酶活性[42-44]。TNF是重要的促炎细胞因子，其Tyr135和Tyr227参与TNF与受体TNFR1的结合，牡荆苷通过作用于这些关键位点可能降低TNF与受体的亲和力，从而抑制下游促炎通路的激活[33, 45]，提示牡荆苷可能通过作用MAPK10和TNF等靶点抑制炎症反应和细胞凋亡从而降低心肌细胞损伤。
而NFE2L2、ALB、HMOX1、MAPK14、PTGS2则是牡荆苷调控铁死亡过程以影响心肌缺血再灌注损伤的关键靶点，其中ALB和MAPK14与牡荆苷结合自由能最低，结合能分别为?8.578 1、?6.901 6 kcal/mol。牡荆苷C环羰基与ALB的Lys190可形成多条氢键，糖苷部分与Leu115、Val116、Tyr138等氨基酸残基均可形成氢键作用力；其A环和C环与Phe169主要产生π-π堆积，1号位氧与Lys53等氨基酸残基可形成氢键相互作用力，并且空间匹配度均较好。以上氨基酸残基大多位于ALB的Sudlow I和Sudlow II部位，是ALB与多种内源性和外源性小分子物质发生结合的热点区域[46-47]，其中Lys190、Leu115、Val116和Tyr138位于肽链主链区域，通过与牡荆苷形成非共价相互作用可能会影响ALB二级结构和三级结构的构象；而Phe169和Lys53位于ALB Sudlow部位周边区域，也可能通过影响局部构象而变化蛋白的整体结合性质[48-49]，分析表明牡荆苷可能通过多点作用ALB关键氨基酸残基，影响ALB与底物的亲和力及其载体功能，抑制ALB与转铁蛋白的协同作用，来发挥调节铁稳态和抗氧化应激作用，从而影响铁在细胞内的释放利用来限制铁死亡过程[50]。MAPK14是铁死亡的重要驱动靶点之一，可传导铁诱导的氧化应激和炎症反应加速细胞铁死亡。以上5个靶点主要参与调控铁稳态平衡、氧化应激及炎症反应等过程，因此牡荆苷可能通过调控这些靶点改变铁死亡过程，进而发挥改善心肌缺血再灌注损伤的作用。
综上，牡荆苷的2-苯基色原酮母核结构、8号位糖基及5号位、4′号位羟基取代基可以与多个心肌缺血再灌注损伤相关靶点的关键氨基酸残基产生结合作用，可能对其发挥改善心肌缺血再灌注损伤的功效非常关键，推测为牡荆苷的关键药效特征结构，对进一步进行基于结构的药物设计、结构修饰和合成生物学研究等均具有重要参考意义。目前牡荆苷的代谢途径及其药代动力学特性尚未被完全揭示，未来的研究可着重于全面阐明牡荆苷在体内的代谢途径，包括主要代谢酶、代谢产物及其药理作用机制。此外，研究不同给药途径对牡荆苷代谢的影响，以及确定其体内过程的关键药代动力学参数，对于指导其临床应用至关重要。同时通过结构修饰或合成类似物，优化牡荆苷的药代动力学特性和药效，将有助于开发更有效的心肌缺血再灌注损伤治疗药物。
本研究利用网络药理学和分子对接手段初步揭示了牡荆苷可与MAPK10、TNF、ALB和MAPK14等关键核心靶点通过氢键、范德华力、π-π堆积等多种分子间作用力稳定结合，并通过作用于癌症通路、流体剪切应力与动脉硬化通路、MAPK信号通路等通路，抑制炎症反应、细胞凋亡及调控铁稳态平滑和氧化应激等铁死亡途径协同作用达到保护心肌免受再灌注损伤来改善心肌缺血再灌注损伤的潜在分子机制，为后续研究提供了调控铁死亡途径改善心肌缺血再灌注损伤的关键线索，同时为开发心肌缺血再灌注损伤临床药物设计及进一步验证其药理机制提供了新的科学依据和研究思路。

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