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基于网络药理学和分子对接探讨心可舒片治疗高血压的作用机制

城头变幻大王骑

2024/09/13

中药/天然药检测

高血压是一种以体循环动脉血压升高为主要特征的临床综合征，是导致脑卒中、冠心病、心力衰竭、肾功能不全等多种重大疾病发生的主要危险因素，具有发病率高、病死率高、致残率高的特点[1]。目前，临床上使用的降压药物虽然可以在短期内有效控制血压，但长期用药容易产生药物不良反应，极大影响治疗的依从性[2]。因此，寻找新的安全有效的降压药物具有重要意义。近年来，中药在控制血压，缓解临床症状，减轻心、脑、肾等靶器官损害等方面展现出独特的优势，受到了人们的广泛关注。心可舒片是由丹参、葛根、三七、山楂、木香组成的中药复方制剂，具有活血化瘀、行气止痛的功效，临床上用于治疗高血压，能够有效改善患者血压水平，减轻炎症反应并促进血管内皮功能恢复，疗效显著，安全性高[3-4]。
网络药理学是一门结合了系统生物学和网络信息学的综合性学科，它能够从多组分、多靶点、多途径的角度阐明中药治疗复杂疾病的分子机制[5]。分子对接是一种计算机模拟技术，可以在原子水平上模拟分子与蛋白质之间的相互作用，预测治疗分子和靶分子之间的亲和力和结合模式[6]。因此，本研究利用网络药理学和分子对接的研究方法，分析心可舒片治疗高血压的有效成分、作用靶点和分子机制，为进一步研究和临床应用提供依据。

1 材料与方法
1.1 心可舒片活性成分、作用靶点的收集与筛选
通过TCMSP、HERB、ETCM数据库，以口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18为条件检索筛选心可舒片中丹参、葛根、三七、山楂、木香5味中药的活性成分，并结合《中国药典》2020年版[7]及文献报道[8-12]补充。利用PubChem数据库获取活性成分SMILES结构式，将其导入SwissTargetPrediction数据库，以probability＞0为筛选条件，预测活性成分的作用靶点。
1.2 高血压疾病靶点的获取
通过OMIM、GeneCards、TTD、DrugBank数据库，以“hypertension”为关键词搜集疾病靶点，将检索结果合并去重后得到高血压相关靶点。借助微生信平台获取药物活性成分与疾病的交集靶点，即得到心可舒片治疗高血压的潜在作用靶点。
1.3 “中药–活性成分–靶点–疾病”网络的构建
将交集靶点及其对应的活性成分导入Cytoscape 3.7.2构建“中药–活性成分–靶点–疾病”网络，利用Network Analyer插件对网络进行拓扑分析并筛选关键活性成分。
1.4 蛋白相互作用（PPI）网络的构建
通过STRING数据库构建交集靶点的PPI网络。物种及最小相互作用阈值分别设置为“homo sapiens”和“high confidence（＞0.7）”。利用Cytoscape 3.7.2软件对PPI网络进行可视化处理，使用插件“CytoNCA”对网络进行拓扑分析并筛选核心靶点。
1.5 基因本体（GO）功能及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析
利用DAVID数据库对交集靶点进行GO与KEGG富集分析，以P＜0.01为条件筛选出主要的生物学过程和具有显著性差异的信号通路，并对结果进行可视化处理。最后运用Cytoscape 3.7.2构建“活性成分–靶点–通路”网络。
1.6 分子对接验证
将“中药–活性成分–靶点–疾病”网络中排名前10位的关键活性成分与PPI网络中排名前6位的核心靶点进行分子对接。通过PubChem和RCSB PDB数据库获取关键活性成分及核心靶点蛋白3D结构，运用Chem3D pro 14.0软件对关键活性成分3D结构进行能量最小化处理。利用Pymol和AutoDock Tools 1.5.7软件分别对小分子和靶点蛋白进行去除水分子、移除配体、增加氢原子、计算电荷以及调整力场参数等操作。最后，使用AutoDock Vina软件进行分子对接，利用Pymol软件将对接结果进行可视化展示。
2 结果
2.1 心可舒片活性成分及作用靶点信息
经数据库检索筛选并结合文献报道和药典补充，同时剔除Swiss Target Prediction数据库中无靶点的成分后，获得丹参70个活性成分，773个作用靶点；葛根17个活性成分，189个作用靶点；木香17个活性成分，410个作用靶点；三七39个活性成分，675个作用靶点；山楂22个活性成分，403个作用靶点。汇总去重后，最终获得心可舒片147个活性成分（表1）和1 011个作用靶点。
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2.2 高血压疾病靶点信息
通过GeneCards（relevance score≥5.43）、OMIM、TTD和DrugBank数据库检索，最终得到948个高血压疾病相关靶点。借助微生信平台获得262个心可舒片与高血压的交集靶点并绘制韦恩图，见图1。
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2.3 “中药–活性成分–靶点–疾病”网络的构建与分析
通过Cytoscape 3.7.2软件构建心可舒片治疗高血压的“中药–活性成分–靶点–疾病”网络，见图2，该网络包括415个节点，3 187条边。利用“Network Analyer”插件，以degree值、中介中心性、紧密中心性大于平均值为条件进行筛选，最终获得15个关键活性成分，见表2。其中degree值排名前10位的是丹参醇A、香紫苏醇、5-羟基-2',3',7,8-四甲氧基黄酮、三裂鼠尾草素、柚皮素、甘草素、丹参醇B、木犀草素、染料木素和山柰酚，这些成分可能在心可舒片治疗高血压的过程中发挥了重要作用。
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2.4 PPI网络的构建与分析
通过STRING数据库和Cytoscape 3.7.2构建PPI网络，该网络包括251个节点和1 254条边。利用CytoNCA插件，以中介中心性、紧密中心性、degree值、特征向量中心性、网络中心性和局部边连通性大于中位数为条件进行筛选，最终获得17个核心靶点，根据degree值进行排序，各节点大小及颜色与degree值呈正比，见图3，其中degree值排名前6位的靶点分别为原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src（SRC）、肿瘤坏死因子（TNF）、信号转导和转录激活因子3（STAT3）、蛋白激酶B（Akt1）、表皮生长因子受体（EGFR）和白细胞介素（IL）-1β。
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2.5 GO与KEGG富集分析结果
GO富集分析获得360个条目（P＜0.01），其中238个与生物学过程（BP）相关，涉及对缺氧的反应、外源性刺激反应、胞浆钙离子浓度的正调控、映射激酶活性的正调控等；41个与细胞组分（CC）相关，涉及质膜组成成分、细胞质膜、细胞表面、膜筏等；81个与分子功能（MF）相关，涉及酶结合、类固醇结合、血红素结合、相同蛋白结合等。根据P值选取BP、CC、MF中排名前10位的条目进行可视化展示，见图4。
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0.01），主要涉及钙信号通路、神经活性配体-受体相互作用、糖尿病并发症晚期糖基化终产物（AGE）及其受体（RAGE）信号通路、环磷酸鸟苷（cGMP）–蛋白激酶G（PKG）信号通路、环磷酸腺苷（cAMP）信号通路等。选取前20条与疾病相关信号通路进行可视化处理，见图5。
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通过Cytoscape 3.7.2构建“活性成分–靶点–通路”网络，见图6，该网络包含317个节点和2 106条边，涉及20条信号通路、138种活性成分和159个靶点，表明心可舒片可通过多成分、多靶点、多途径发挥对高血压治疗作用。
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2.6 分子对接结果分析
将“中药–活性成分–靶点–疾病”网络中排名前10位的关键活性成分（丹参醇A、香紫苏醇、5-羟基-2',3',7,8-四甲氧基黄酮、三裂鼠尾草素、柚皮素、甘草素、丹参醇B、木犀草素、染料木素、山柰酚）与PPI网络中排名前6位的核心靶点（SRC、TNF、STAT3、Akt1、EGFR、IL-1β）进行分子对接，见图7。结果显示，关键活性成分与核心靶点的结合能均小于?5.0 kcal/mol（1 cal＝4.2 J），多数结果的结合能小于?7.0 kcal/mol，表明关键活性成分与核心靶点间均有较好的结合能力，且大部分具有较强的结合能力[13]。以上结果表明，心可舒片中的活性成分均可自发地与核心靶点蛋白结合，进而发挥对高血压的治疗作用。使用Pymol软件将部分结果进行可视化展示，见图8。
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3 结论
高血压属于中医学理论中“眩晕”“头痛”的范畴，其病因与痰湿中阻、气血瘀滞、清窍失养所致的气血阴阳失调有关[14]。心可舒片具有活血化瘀、行气止痛的功效，临床上用于治疗高血压，疗效确切，作用显著。本研究运用网络药理学的方法对心可舒片治疗高血压的潜在活性成分及靶点进行挖掘，探讨其可能的作用机制，并采用分子对接技术进行验证。
“中药–活性成分–靶点–疾病”网络拓扑分析结果表明，丹参醇A、香紫苏醇、5-羟基-2',3',7,8-四甲氧基黄酮、三裂鼠尾草素、柚皮素、甘草素等可能是心可舒片发挥降压作用的关键活性成分，研究表明，丹参醇A能够显著改善自发性高血压大鼠的血压水平和心脏功能[15]。香紫苏醇和三裂鼠尾草素能够舒张血管并改善血压[16-17]。柚皮素能够通过抑制肾损伤分子、盐皮质激素受体和血管紧张素转换酶的表达进而发挥降压作用[18]。甘草素可通过调节氧化应激水平和钙离子通道活性发挥保护心血管的作用[19]。
PPI网络分析发现，SRC、TNF、STAT3、Akt1、EGFR、IL-1β等可能是心可舒片治疗高血压的核心靶点。SRC是一种非受体酪氨酸激酶，其能够激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NOX）产生活性氧（ROS）并引发氧化应激反应，最终导致高血压等心血管疾病发生发展[20]。TNF是一种炎性细胞因子，其表达水平与高血压的发生和严重程度密切相关，此外，TNF抑制剂已被证明可有效降低高血压患者的血压[21]。STAT3在高血压发展进程中发挥着重要的作用，其能够通过多种机制引发血管壁炎症、血管平滑肌细胞（VSMC）表型转化、血管重构等病理变化进而加重高血压进展[22]。Akt1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其能够通过调控内皮一氧化氮合成酶（eNOS）活性并促进一氧化氮的生成，从而发挥舒张血管、调节血压的作用[23]。EGFR是一种跨膜受体酪氨酸激酶，其能够诱导血管收缩并增加外周血管张力，最终导致血压升高[24]。IL-1β作为一种重要促炎因子，其可通过介导炎症信号传导、调节VSMC功能和细胞外基质（ECM）重塑等途径促使高血压的发生[25]。
GO功能富集结果显示，心可舒片主要通过对缺氧的反应、对外源性刺激的反应、胞浆钙离子浓度的正调控、映射激酶活性的正调控等生物过程发挥治疗高血压的作用。KEGG通路富集结果表明，心可舒片治疗高血压与钙信号通路、神经活性配体–受体相互作用、AGE-RAGE信号通路、cGMP-PKA信号通路、cAMP信号通路等密切相关。钙信号通路在高血压的形成和发展中发挥着重要的作用，研究发现，钙信号通路异常会导致细胞内钙离子浓度增加，进而引发血管平滑肌收缩和血管外周阻力增大，最终引起血压升高[26]。神经活性配体–受体相互作用与神经系统功能密切相关，而自主神经的失衡，特别是交感神经系统的异常激活被认为是高血压的主要发病机制之一[27]。AGE-RAGE信号通路中的AGE是一种由蛋白质、核酸和脂质与还原糖进行非酶促反应形成的稳定化合物，其与RAGE结合后可通过产生ROS、激活核因子κB（NF-κB）以及增加促炎细胞因子表达等多种机制诱发高血压[28]。cGMP-PKA信号通路能够通过多种途径调节VSMC中的钙离子水平进而发挥舒张血管、稳定血压的作用[29]。cAMP信号通路能够通过抑制Ras同源基因家族蛋白A（RhoA）/Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK）信号传导、激活肌球蛋白轻链磷酸酶（MLCP）并减少肌球蛋白磷酸酶靶向亚基（MYPT1）抑制性磷酸化来诱导血管舒张，进而发挥降压效果[30]。分子对接结果显示，关键活性成分与核心靶点间具有良好的结合能力，提示心可舒片可能通过调节SRC、TNF、STAT3、Akt1、EGFR、IL-1β等靶点发挥降压作用，进一步验证网络预测结果的可靠性。
综上所述，本研究通过网络药理学的方法和分子对技术初步揭示了心可舒片可能通过丹参醇A、香紫苏醇、5-羟基-2',3',7,8-四甲氧基黄酮、三裂鼠尾草素、柚皮素等活性成分，作用于STAT3、TNF、SRC、Akt1、EGFR、IL-1β等靶点，调控钙信号通路、AGE-RAGE信号通路、cGMP-PKG信号通路、神经活性配体–受体相互作用等信号通路，进而舒张血管、减轻炎症反应、改善血管内皮功能，起到治疗高血压的作用，体现了其多成分、多靶点、多途径的治疗特点，为后续研究及临床应用提供参考。

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