超高效液相色谱-串联质谱法测定果蔬中灭蝇胺的含量
户江涛
（黑龙江省农垦科学院测试化验中心，黑龙江 佳木斯 154007 ）
摘要：采用超高效液相色谱-串联质谱法建立了检测果蔬中灭蝇胺含量的分析方法。试样经1%三氯乙酸溶液提取，MCX固相萃取柱净化，灭蝇胺在C18色谱柱上以2 mmol/L乙酸铵+0.1%甲酸水溶液和乙腈为流动相，进行液相色谱分离；质谱检测采用电喷雾正离子化模式和多反应监测模式（MRM）。结果表明，灭蝇胺在0.002~0.05 mg/L范围内线性关系良好，相关系数（R）为0.9998，定量限（LOQ）为0.002 mg/kg。在果蔬空白样品添加浓度为0.002、0.05、0.5 mg/kg时，灭蝇胺的平均回收率为86.1%~94.6%，相对标准偏差（RSD）为1.86%~5.18%（n=6）。本方法简便、灵敏、抗干扰，适用于果蔬中灭蝇胺含量检测。
关键词：超高效液相色谱-串联质谱；果蔬；灭蝇胺
Determination of Cyromazine in Vegetable and Fruit by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
HU Jiangtao
(Testing and Analysis Center of Heilongjiang Academy of Land Reclamation Sciences, Jiamusi 154007,China)
Abstract：A method was developed for the determination of Cyromazine in Vegetable and Fruits by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS). The sample was extracted by 1% TCA, purified by MCX solid phase extraction cartridge. Cyromazine was separated on a Waters BEH C18 column with gradient elution with the mobile phase of 2 mmol/L NH4 AC +0.1% FA and acetonitrile, and finally detected by positive eletrospray ionization-mass spectrometry(ESI+-MS/MS) in multiple reaction monitoring(MRM) mode. The results showed the linearity of Cyromazine was good in the concentration range of 0.002~0.05 mg/L , and the correlation coefficient was 0.9998. The limit of quantification(LOQ) of Cyromazine was 0.002 mg/kg. At the spiked levels of 0.002、0.05、0.5 mg/kg in the blank of vegetable and fruit, the mean recovery of Cyromazine was 93.1%~95.7%, and the relative standard deviation(RSD) of Furosine was 1.16%~1.71%（n=6）.This method is simple, sensitive, anti-jamming and suitable for simultaneous determination of Cyromazine in vegetable and fruit.
Key words: ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-
MS/MS); Cyromazine ; Vegetable and Fruit
灭蝇胺（Cyromazine）又名环丙氨嗪，分子式为C6H10N6，属于三嗪类强内吸性昆虫生长调节剂，可以抑制双翅目幼虫和蛹成虫羽化，主要用来防治蔬菜、水果和观赏类植物上的美洲斑浅蝇和潜叶蝇等农业害虫。为保障食品安全，我国国家标准《GB 2763-2021 食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》中规定了不同种类农产品中灭蝇胺最大残留限量——豇豆等豆类蔬菜（0.5 mg/kg）、黄瓜（1 mg/kg）、叶菜类蔬菜（3-20 mg/kg）、瓜果类水果（除西瓜外，0.5 mg/kg）、鲜食蘑菇（平菇 1 mg/kg，其它7 mg/kg）等。
目前，灭蝇胺的检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-质谱法（LC-MS/MS）、量子点荧光探针法等。《NY/T 1725-2009》采用的HPLC法需要用氨基柱，紫外检测器响应相对质谱较低，且容易受基质干扰可能导致定性、定量不够准确；而LC-MS/MS法通过选定目标物的特征离子，MRM模式下能有效去除杂质干扰，使定性、定量更加准确可靠。因此本研究拟建立果蔬中灭蝇胺检测的UPLC-MS/MS法，通过优化前处理方式，使整个分析过程更加简便、快速、高效，可以作为GB 23200.121等农残检测方法标准的有益补充。
1 实验部分
1.1 材料与试剂
灭蝇胺（CAS：66215-27-8，农业部环境质量监督检验测试中心（天津））；乙酸铵（色谱纯，天津科密欧公司）；甲酸、乙腈（色谱纯，Fisher公司）；实验用水为Millipore纯水仪制备。
1.2 仪器与设备
Acquity UPLC型超高效液相色谱仪（Waters公司）；XEVO TQ-MS三重四级杆质谱仪（Waters公司）；MCX固相萃取柱（60 mg/3 mL，Waters公司）；匀浆机、涡旋混合器（IKA公司）。
1.3 样品前处理
提取：称取粉碎均匀后的试样5.00g（精确到0.01g）于50 mL聚乙烯离心管中，加入10.0 mL1%三氯乙酸溶液，20000 r/min匀浆1 min，以10000 r/min离心3 min，将上清液转移至25 mL容量瓶中，再加入10.0 mL1%三氯乙酸溶液重复上述操作，合并两次上清液并用1%三氯乙酸溶液定容至25 mL混匀后，准确吸取5.0 mL待净化。
净化：MCX小柱使用前依次用3 mL甲醇、3 mL水活化，然后将待净化液转移至MCX柱中，待提取液全部通过后再分别依次用3 mL水、3 mL甲醇淋洗后挤干，用3 mL 5%氨化甲醇洗脱，收集洗脱液，再将洗脱液置于50℃水浴中用氮气吹至近干，残留物用1.00 mL2 mmol/L乙酸铵+0.1%甲酸水溶液+乙腈（95+5）定容，涡旋混匀后过0.22 um有机系滤膜，供UPLC-MS/MS测定。
1.4 液相色谱及质谱条件
液相色谱：色谱柱:Waters BEH C18（1.7 μm，50mm×2.1mm）；柱温：30℃；流速：0.3mL/min；进样量：2 μL；流动相A：乙腈；流动相B：2 mmol/L乙酸铵+0.1%甲酸水溶液。梯度洗脱程序：0~1.0 min，5% A；1.0~3.0 min，5%~100% A；3.0 ~4.0 min，100%A，4.0 ~4.1min，100% A~5% A，4.1 ~5.0min 3% A。
质谱：离子源：电喷雾离子源( ESI + ) ；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测( MRM)；毛细管电压：3.2 kv；离子源温度：150℃；去溶剂气温度：500℃；去溶剂气流量：1000 L /h；定性、定量离子对及碰撞能量见表1。
表1灭蝇胺的质谱参数
Table 1 MRM parameters of Cyromazine
Analyte | Cone/V | Parent ion/(m/z) | Daughter ion/(m/z) | Collision energy/V |
Cyromazine | 25
| 167
| 108﹡ 80 | 19 19 |
﹡quantitative ion
2 结果与讨论
2.1色谱及质谱条件的优化
色谱的选择：灭蝇胺极性强，C18填料色谱柱对其很难保留，可以考虑氨基柱作为分析柱（《NY/T 1725-2009》HPLC法）；但在农残实际检测中，一般都是上百种组分同时分析（除非是专门检测灭蝇胺），得兼顾大多数参数（绝大多数C18柱分离效果很好），因此进行农残多残留分析时还是需要优先选择C18分析柱；虽然灭蝇胺在C18柱上保留时间较短，但液质的优势在于MRM模式可以通过只扫描灭蝇胺特征离子从而避开基质干扰，即使出峰靠前也几乎不会受到干扰（见图2），从农药多残留高通量分析检测角度考虑，选择C18填料色谱柱，流动相为2 mmol/L乙酸铵+0.1%甲酸水溶液和乙腈。
质谱的选择：灭蝇胺分子量为166.2。将1.0 mg/L 灭蝇胺标准溶液直接注射到质谱中，在正离子模式下分别进行母离子全扫描，发现167离子具有很好的响应，然后分别以167为母离子进行子离子全扫描，得到定性、定量子离子对进行MRM监测，最终确定的质谱条件见表1。
2.2 提取试剂的优化
灭蝇胺的Pka值为7.5，呈弱碱性，极性非常强，实验中发现参照农产品农残检测常用标准《GB 23200.121-2021 食品安全国家标准 植物源性食品中331种农药及其代谢物残留量的测定 液相色谱—质谱联用法》的乙腈提取、QuEChERS净化方式前处理，灭蝇胺的回收率只有40%-50%左右，因此该标准没有将灭蝇胺列入；农业行业标准《NY/T 1725-2009 蔬菜中灭蝇胺残留量的测定 高效液相色谱法》采用0.05 mol/L乙酸铵+乙腈（1+4）提取液，强阳离子交换柱（SCX）净化，该方法加入了一定比例乙酸铵对提高灭蝇胺这类极性强的组分提取效率有一定帮助——该前处理方法灭蝇胺回收率能达到80%以上，但乙酸铵+乙腈溶液组合不能直接过SCX柱，需要旋蒸近干后再加入盐酸溶液进行酸化才能过SPE小柱，导致前处理费时费力费试剂。结合灭蝇胺Pka值，考虑用酸化试剂作为提取液，这样就可以直接过阳离子交换小柱，省去了旋蒸浓缩步骤，可大大提高检测效率。灭蝇胺Pka值为7.5，为保证其在MCX（混合型阳离子交换柱）上有较好的保留，提取液pH值应＜5.5（待测物在小于其Pka值两个单位的溶液环境中99%以上呈离子状态），通过查阅相关资料，发现三氯乙酸能够很好的溶解弱碱性物质，同时还可以沉淀蛋白等大分子，经过试验比对最终选用1%三氯乙酸溶液作为果蔬中灭蝇胺检测的提取溶液，得到了很好的回收率，具体实验结果见表3-5。
图1 灭蝇胺标准溶液（0.01 mg/L）MRM色谱图
Fig.1 MRM chromatograms of Cyromazine standard solution at 0.01 mg/L
图2 黄瓜样品中灭蝇胺MRM色谱图
Fig.2 MRM chromatograms of Cyromazine in Cucumber
2.3线性范围和定量限
吸取不同体积的灭蝇胺标准储备液，用初始流动相分别配置0.002、0.005、0.01、0.02、0.05 mg/L的灭蝇胺上机标准溶液，以各自定量离子的峰面积为Y对应质量浓度X（mg/L）做标准曲线，得到的线性方程和相关系数见表2。结果表明，灭蝇胺标准溶液在0.002~0.05 mg/L浓度范围内线性良好，相关系数R为0.9998。以10倍信噪比（S/N）计算，该方法灭蝇胺的定量限（LOQ）为0.002 mg/kg。
表2 灭蝇胺标准溶液的线性方程、相关系数和定量限（LOQ）
Table 2 Linear equation, correlation and LOQ of Cyromazine in standard solutions
Analyte | Linear range/(mg/L) | Linear equation | R | LOQ/(mg/ kg) |
Cyromazine | 0.002~0.05 | Y=6786.7X+33.807 | 0.9998 | 0.002 |
2.4回收率和精密度
分别称取不含灭蝇胺的黄瓜、菜豆、苹果空白试样各5.00 g，添加0.002、0.05、0.5 mg/kg水平的灭蝇胺标样，每个水平重复6次，按照1.3前处理方法处理后上机检测，回收率计算结果见表3-5。从表3-5可以看出，灭蝇胺的平均回收率为86.1%~94.6%，相对标准偏差（RSD，n=6）为1.86%~5.18%。
表3 黄瓜中灭蝇胺的加标回收率和相对标准偏差（n=6）
Table 3 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of Cyromazine in Cucumber（n=6）
Analyte | Spiked level(mg/kg) | Recovery/% | RSD/% |
Cyromazine
| 0.002 0.05 0.5
| 86.1 92.3 90.7
| 3.37 2.66 2.13
|
表4 菜豆中灭蝇胺的加标回收率和相对标准偏差（n=6）
Table 4 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of Cyromazine in Kidney bean（n=6）
Analyte | Spiked level(mg/kg) | Recovery/% | RSD/% |
Cyromazine
| 0.002 0.05 0.5
| 93.0 91.9 94.6
| 5.18 2.76 3.01
|
表5 苹果中灭蝇胺的加标回收率和相对标准偏差（n=6）
Table 5 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of Cyromazine in Apple（n=6）
Analyte | Spiked level(mg/kg) | Recovery/% | RSD/% |
Cyromazine
| 0.002 0.05 0.5
| 87.9 93.7 93.3
| 3.60 4.39 1.86
|
2.5 讨论
灭蝇胺作为一种昆虫生长调节剂，相比一些传统农药对人体、环境安全性要高不少，因此被广泛使用，但随之带来的药物残留等问题也日趋严重，因此灭蝇胺已被列入农产品例行监测农残必检参数。鉴于每次监测农残参数有近百种，且样品数量也很大，不大可能将灭蝇胺作为特殊参数单独进行样品前处理，在大批量样品农残筛查实际工作中，还是采用GB 23200.121 乙腈提取、QuEChERS净化的方式前处理（该方法灭蝇胺回收率基本能稳定在40%-50%），若在筛查时发现有灭蝇胺含量大于等于其在GB 2763各类果蔬中限量值的四分之一的情况，则需要用本研究方法确认得到准确含量，低于限量值四分之一时一般直接折算45%回收率作为最终样品中灭蝇胺的含量值。
3 结语
本文建立了超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）测定果蔬中灭蝇胺含量的分析方法。该方法灵敏度高，灭蝇胺定量限（LOQ）达到0.002 mg/kg，其灵敏度能满足GB 2763各类果蔬中灭蝇胺限量要求。同时该方法具有较高的准确度和精密度，前处理步骤简单，分析速度快，可以作为GB 23200.121等农残检测方法标准的有益补充。
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