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96孔板单克隆成球分析

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2024/10/08

生命科学仪器综合讨论

96孔板单克隆成球分析

实验操作：

1. 将培养皿内SD细胞悬液轻轻吸入15ml离心管，800rpm/min，5min，离心

2. 弃上清液，轻轻沿离心管管壁加入2ml ES培养基，1ml枪头匀速吹散细胞沉淀，尽量不要产生气泡，吹打次数约为30次

3. 800rpm/min，5min，离心

4. 弃上清液，ES培养基吹散细胞沉淀，细胞悬液浓度计数

5. 根据计数结果，配制1x10⁶ cells/ml浓度的细胞悬液（若原细胞悬液浓度过低，也可先配制1x10⁵ cells/ml浓度的细胞悬液），配置1ml即可，漩涡震荡器轻轻震荡，使细胞悬液混匀

6. 按照梯度稀释的方法，稀释梯度为10倍（100ul 细胞悬液 + 900ul ES培养基），依次配制1x10⁵ cells/ml , 1x10⁴ cells/ml , 1x10³ cells/ml细胞悬液，每次均用漩涡震荡器轻轻震荡，混匀细胞悬液

7. 取1x10³ cells/ml细胞悬液120ul加入含有11.88ml ES培养基的50ml离心管内，漩涡震荡器轻轻震荡，混匀细胞悬液，得到终浓度为10 cells/ml的细胞悬液

8. 向96孔板每个孔内加入100ul 终浓度为10 cells/ml的细胞悬液，枪头预留部分液体，避免产生气泡

9. 加完96孔板前48个后，重新使用漩涡震荡器轻轻震荡，重新混匀细胞悬液，加完剩余96孔板

10. 10倍物镜下，逐一检查96孔板每个孔内是否有且只有一个细胞，标记有且只有一个细胞的孔并统计孔数，记为A，用以计算单细胞种植成功率A/96 x 100%；若发现孔内有细胞，且细胞数量大于或者等于2个，则在统计结果时舍弃该孔。检查完成后移入37度培养箱

11. 10天后，逐一检查96孔板内是否有单克隆球形成并统计成球数量，记为B，若单克隆成球均出现在当时检查为有且只有一个细胞的96孔板孔中，则细胞单克隆成球率为B/A x 100%；若当时检查为无细胞的孔中依然出现单克隆成球，则说明在检查单细胞种植成功率时，该孔结果为假阴性，此时需要对数值A进行校正，假设当时检查为无细胞的孔中依然出现单克隆成球，这些孔的数量为C，则单细胞种植成功率为(A+C)/96 x 100%，单克隆成球率为B/(A+C) x 100%

12. 按照以上同样实验方法，至少设置三次不同时间点的重复实验

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