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细胞CCK-8增殖分析（反映群体细胞的生长）

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2024/10/08

生命科学仪器综合讨论

细胞CCK-8增殖分析（反映群体细胞的生长）

（一）原理

a在电子耦合试剂环境中，WST-8可被活细胞线粒体内的一些脱氢酶还原成橙黄色的甲臜（formazan）,橙黄色的深浅与细胞的增殖成正比

b用酶标仪在450mm波长处测定OD值，可计算细胞群体的细胞活力，间接反映活细胞的数量

c以活力值为纵坐标，测定时间为横坐标，绘制生长曲线，可计算细胞的倍增时间（即在生长曲线上细胞数量增加1倍的时间 ,细胞倍增的时间区间即为对数生长期,细胞传代,实验多在此区间进行）

(二) 材料

LLC-ASD细胞 CCK-8 kit 96孔板含5%FBS的DMEM培养液（含抗生素）酶标仪超净台培养箱

（三）操作步骤

1 画板：

建议96孔板最外一圈的孔加入100ul/孔的PBS，中间接种 6day x 5个100μL/孔的含1000个细胞的细胞悬液并设置仅含5 个100ul/孔培养基的副孔作为空白对照。

2接种与预培养：

收集细胞，计数后用含5%FBS的DMEM培养液极限梯度稀释得5ml 1×104个/ml，剩余的细胞重新收集，以便以后做RT-PCR验证实验。

按实验设计接种细胞，注意接种时不可产生气泡，然后在培养箱中预培养30min

3 加CCK-8与培养：

day0的5个孔和空白对照每孔加入10 ulCCK-8溶液，摇匀后在培养箱内孵育1.5h

4 测定当天加入CCK-8各孔在450mm波长处OD值，记录

5 每隔24h向day1~day5相应各孔加入10 ulCCK-8溶液，摇匀后在培养箱内孵育1.5h测定当天加入CCK-8各孔在450mm波长处OD值，记录

（四）细胞的倍增时间的计算：

1计算空白对照组的OD值的均值A

2 day0~day5各孔OD值均减去A，记为当如该孔的细胞活力值

3以细胞活力值为纵坐标，测定时间为横坐标，绘制生长曲线，根据生长曲线确定细胞生长的对数期

4计算倍增时间

其公式为:

Td=Δt×Lg2/(LgNt-LgN0)定义Td为倍增时间,Δt为计数间隔时间,Nt为对数生长期任一点在生长曲线上的理论观察值,N0为对数生长期在生长曲线上的理论初始值

注意：

1.当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔 (100 μl 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100 μl 培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。

2.在实验中吸光度值太高，如果不能减少细胞数量，可以缩短加入CCK8后的培养时间。例如：可以把加入CCK8试剂后的培养时间由2小时缩短为1小时。

3.在CCK-8显色过程中，如何终止反应？

有以下几种方法（96孔板）：

在显色反应后，将培养板放置4℃冰箱内。

每孔加10 μl 0.1 M HCL溶液。

每孔加10 μl 1%（w/v）的SDS（十二烷基硫酸钠）溶液。注意：反应停止后，应在24小时之内测定。

4.必须预培养细胞吗？

不一定。如果要向保持细胞的最好状态，建议预培养细胞。如果不做细胞预培养，细胞内的脱氢酶可能会不稳定。也有人不做细胞预培养，但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。

5.CCK-8对于不同的细胞，灵敏度是否一样？

不一样，悬浮细胞与贴壁细胞相比较难染色。对于贴壁细胞，一般加入CCK-8培养1-4小时吸光度已经很高，但对于悬浮细胞则可能吸光度较低，可以通过延长CCK-8的加入时间或增加细胞数量来解决。

6.悬浮细胞和贴壁细胞在数量上有何区别？

悬浮细胞由于染色比较困那，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。贴壁细胞染色比较容易，若细胞数量过大，有时吸光度会超过酶标仪的读数。

7.实验之前，是否需要先检测一下培养基和CCK-8是否会反应？

在避光条件下CCK-8试剂在4℃可保存一年。如果需要保存较长时间的话，推荐在-20℃下保存。但是CCK-8若反复解冻和冰冻将会增加空白吸收，从而影响检测结果，若经常使用可将试剂存放在4℃冰箱内保存。

建议使用一个孔作一下检测，因为有培养基中可能含有氧化还原反应的物质，在正式实验之前有必要先确认培养基和CCK-8是否反应。一般正常在的OD值应该在0.4以下。

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