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高效液相色谱基础篇|关于亲水作用色谱柱使用的小知识

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2024/10/10

液相色谱（LC）

今天我们聊一款常用于极性化合物分析的色谱柱-亲水作用色谱柱，如果大家在实际使用过程中有遇到，可以参考。在HILIC中，流动相由高比例的有机溶剂和低比例的水相组成，这种组成有利于提高极性化合物的保留。固定相表面的极性官能团能够与流动相中的水分子形成一层稳定的水合层，这层水合层有助于极性化合物的保留。因此，HILIC特别适合于分析在反相色谱中保留较差的极性物质。

01.HILIC色谱柱的组成

1）色谱柱管：

色谱柱管通常是由不锈钢制成管状结构，用于容纳填料。

2）填料：

固定相是极性材料，通常是基于硅胶或聚合物基质，表面键合有极性官能团。这些官能团可以是氨基、二醇基、酰胺基、氰基、硫酸酯钠等，它们与分析物中的极性基团相互作用，如形成氢键，从而实现分离。

02.HILIC色谱柱的分离机制
1）样品加载：在HILIC中，待分离的极性样品在流动相的携带下被加载到色谱柱上。由于固定相具有极性官能团，它能够吸引样品中的极性分子。
2）水合层形成：固定相表面的极性官能团能够在有机溶剂为主的流动相中捕获一层水分子，形成水合层。这层水合层是HILIC保留极性分子的关键。3）相互作用：样品中的极性分子与固定相表面水合层之间的相互作用，如氢键、偶极-偶极相互作用等，导致极性分子被保留。这些相互作用的强度决定了分子在柱上的保留时间。
4）洗脱：为了使保留在柱上的极性分子洗脱，可以采取改变流动相组成的方法，如增加有机溶剂的比例，减少水合层的稳定性，或者通过梯度洗脱逐渐改变流动相的极性，从而逐渐削弱极性分子与水合层的相互作用。
5）检测与收集：随着极性分子的洗脱，它们通过检测器进行检测，检测器根据分子的物理化学性质（如紫外吸收、荧光、质谱响应等）进行响应。根据实验需求，可以将特定时间洗脱的分子收集起来进行进一步分析。

03.HILIC色谱柱使用的注意事项

1）使用前：
a. 检查色谱柱包装和标签：确保色谱柱没有物理损伤，确认色谱柱的规格和填料类型符合实验需求。
b. 阅读说明书：仔细阅读色谱柱的使用说明书，了解色谱柱的pH稳定性范围、最大操作压力等参数。
c. 色谱柱保存液置换：新色谱柱采用梯度洗脱的方式，逐渐改变溶剂组成，使色谱柱从一种状态平稳过渡到另一种状态。
2）使用中：
a. 流动相选择：流动相中应至少保持5%的极性溶剂，如5%水相缓冲液或3%甲醇/2%水相缓冲液等，以保证HILIC硅胶填料始终被水浸润。同时，有机溶剂（如乙腈）的比例不应低于40%。避免使用磷酸盐缓冲溶液体系，因为磷酸盐在HILIC色谱模式下可能会析出。
b. 样品溶解性：样品应尽量溶解在与流动相组成相同的溶剂中。若使用含水量高的溶剂，可能会导致分离能力降低。建议使用含有机溶剂50%以上的溶液进行稀释。
c. 色谱柱的平衡：在开始进样前，用20倍柱体积的起始流动相平衡色谱柱。进行梯度分析时，进样间隔需要用10倍柱体积起始流动相平衡色谱柱。d. 色谱柱的温度：HILIC色谱柱对温度敏感，因此在使用过程中需要控制好柱温，一般推荐的柱温范围为20-40℃。
e. pH控制：HILIC色谱柱在分析过程中可能受到溶剂pH的影响，因此对于一些对pH敏感的化合物，需要进行pH调整以获得更好的保留和分离效果。f. 色谱柱的压力：避免超过色谱柱的最大使用压力，通常不超过20MPa。
3）使用后：

a. 柱子清洗：如果色谱柱被污染，可以使用50/50的乙腈/水溶液清洗以去除极性污染物。如果清洗无效，可使用更高比例的乙腈/水溶液进行清洗。

b. 柱子保存：短期内不使用色谱柱时，应将其保存在95%乙腈中。长期不使用时，先用10倍柱体积的HPLC级水清洗色谱柱，然后换上95%乙腈保存。

c. 记录使用情况：记录色谱柱的使用情况，包括分析的样品、使用条件和色谱柱表现，以便于追踪柱效和寿命。

04.HILIC色谱柱使用的局限性

1）样品溶剂与流动相不匹配：这可能导致色谱峰变形，损害待分析物进入固定相中的分配，对分析物的色谱峰形状不利，还容易造成色谱柱过载，降低保留和分离度。

2）动力学性能：HILIC的作用机理在动力学上比RPLC要慢，导致需要较长的色谱柱平衡时间，通常比RPLC模式中多两到四倍。

3）pH值测量困难：当采用高比例的有机溶剂时，无法准确测量流动相的pH值，这可能对某些对pH敏感的化合物分析造成困难。

4）盐析效应：在高盐浓度下，可能会出现盐析效应，导致某些化合物的保留行为发生变化。

5）缓冲盐的选择：在HILIC模式下，不是所有的缓冲盐都适合使用，如磷酸盐缓冲液可能会在HILIC色谱模式下析出。

05.亲水作用（HILIC）色谱柱与反相（RPC）色谱柱的区别

1）固定相：RPC：通常使用非极性或疏水性固定相，如C18（十八烷基键合硅胶）。HILIC：使用极性固定相，如硅胶、聚合物或其他极性材料，表面可能键合有极性官能团。
2）流动相：RPC：流动相通常是含水的有机溶剂，如水和乙腈或甲醇的混合物。HILIC：流动相是含有机溶剂的水溶液，即高比例的有机相和低比例的水相。
3）分离机制：RPC：基于分析物在固定相和流动相之间的分配系数差异，疏水性较强的分析物更容易与疏水性固定相相互作用，因此保留时间较长。HILIC：基于分析物与固定相表面的水合层之间的相互作用，极性较强的分析物更容易与固定相表面的水分子发生相互作用，因此保留时间较长。
4）选择性：RPC：适合分离疏水性较强的分析物，如非极性或中等极性分子。HILIC：适合分离极性较强的分析物，如糖、氨基酸、极性代谢物等。5）洗脱顺序：RPC：极性较强的分析物先被洗脱，极性较弱的分析物后被洗脱。HILIC：极性较弱的分析物先被洗脱，极性较强的分析物后被洗脱。6）应用：RPC：广泛应用于各种有机小分子的分离，包括药物、代谢物、肽类等。HILIC：特别适用于极性化合物的分离，这些化合物在RPLC中可能保留不好或无法保留。

总结一下：

亲水作用色谱柱（HILIC）是一种专门设计用来分析极性化合物的色谱技术。它的色谱柱内部通常由不锈钢制成，并填充有极性官能团的填料，如硅胶或聚合物。这些官能团能够与流动相中的水分子形成稳定的水合层，从而帮助保留极性分子。HILIC的流动相是由大量有机溶剂和少量水相组成的，这与反相色谱（RPC）正好相反，后者使用含水的有机溶剂作为流动相。

使用前，需要注意流动相的选择，确保至少含有5%的极性溶剂来维持水合层，并且有机溶剂比例不低于40%。样品应溶解在与流动相极性相近的溶剂中，以避免峰形异常。而使用过程中要控制好色谱柱的温度和压力，避免超过其最大承受压力。使用后，需要适当清洗色谱柱，并在95%乙腈中保存以保持性能。

虽然HILIC色谱柱在分析极性化合物方面表现出色，但也存在一些局限性，比如样品溶剂与流动相不匹配可能导致色谱峰变形，pH值测量困难，以及盐析效应可能影响化合物的保留行为。此外，HILIC的平衡比RPC慢，需要更长的平衡时间。

总的来说，HILIC色谱柱是分析极性化合物的有力工具，但使用时需要细心操作和维护，以确保最佳的分离效果。

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