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基于质谱蛋白组学的MRD监测对于肝癌转化治疗疗效预测的研究

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2024/10/10
小矮马

基于质谱蛋

原发性肝癌是全世界范围内常见的恶性肿瘤之一，因肝癌发病隐匿，早期症状不明显，我国大多数肝癌病人在初诊时已属于中晚期，已不宜首选手术切除，而应接受以非手术局部治疗和系统治疗为主的治疗。肝癌转化治疗是通过TACE或核素内放射治疗、外放射治疗、药物等辅助手段肿瘤缩小、降期，将不可切除肝癌转为可切除肝癌，然后切除肿瘤并加以术后药物控制，实现病患生存质量和长期生存的一种晚期肝癌临床手段。转化治疗及其相关领域仍存在许多亟待解决的临床和科学问题，包括如何预测转化治疗的疗效，缓解后是否需要手术切除，如何确定最佳手术切除的时机，切除术后是否需要辅助治疗，术后辅助治疗到什么阶段，是否存在术后复发的风险及不同治疗方式组合的适应人群是什么等等。本研究拟通过利用质谱的蛋白组学监测手段对患者血液样本进行监测，通过生物信息学统计分析，以期从中发现可以用于肝癌患者转化疗法（本次临床实验的疗法）的适用人群特征、药物疗效监测标志及风险预警标识，对于目前的肝癌转化疗法临床应用有着极大的指导意义，对于肝癌转化疗法的临床分诊、用药方案、术后风险评估及复发监测具有重要临床转化价值。

（一）主要研究内容

基于术前辅助治疗的效果（转化效果），对接受转化疗法（本次研究课题内容）的患者进行分组，并通过对两组患者治疗前血浆样本进行DIA 定量蛋白质组学监测，获得可从转化疗法中获益和非获益患者的血浆蛋白组学特征，并通过比较分析筛选可获益患者的特征性蛋白谱及其涉及的功能网络，并从中锁定可准确预测收益患者的特征标志物分子进行验证，以期找到可用于临床后期能够用于分诊的标志物，回答什么样的患者适用于该转化疗法方案。

（二）研究方法

1.研究对象：2023年01月01日-2023年10月01日期间在河北大学附属医院肝胆外科接受TACE联合信迪利单抗和贝伐珠单抗治疗或者信迪利单抗和仑伐替尼治疗的无法手术切除的中晚HCC患者。

2.纳入与排除标准

2.1纳入标准:

1.年龄18-75岁的初治患者；

2.经临床及影像学确诊的原发性肝细胞肝癌，Child-Pugh A 或 B 级；

3.不可切除的手术定义（符合以下之一）：单发肿瘤体积占肝体积50%以上，并且剩余肝＜30%正常肝体积或剩余肝重量/体重＜5%；分布于左右肝的多发肿瘤（＞3个），且病灶最大直径大于4cm；

4.肿瘤经肝癌转化治疗 MDT 团队评估后无法手术切除；

5.无TACE、靶向治疗及免疫治疗的禁忌症；

6.不合并严重的肝肾功能损伤；

7.患者同意并签署相关知情文件。

2.1排除标准:

1.合并其他恶性肿瘤或非原发性肝细胞肝癌的患者；

2.合并其他严重的基础疾病，6个月内有严重的出血史；

3.合并严重的肝肾功能；

4.Child-Pugh C 级；

5.既往接受相关治疗：手术治疗、介入及其他局部或全身治疗；

6.临床资料缺失。

3.分组：选取符合上述标准的原发性肝细胞肝癌患者，患者均接受TACE联合信迪利单抗和贝伐珠单抗治疗或者信迪利单抗和仑伐替尼治疗。转化治疗3-6个周期后，通过改良实体瘤的疗效评估标准RECIST(m RECIST)评估转化治疗效果，并根据转化治疗的疗效，将病人分为A组有益组和B组无益组(预计每组各15例)。

4.研究方法（与谱天生物科技有限公司合作）

血浆样本收集方法：

1. 使用EDTA、streck、无添加采血管采集患者入院新鲜静脉血（样本量≥200μl/sample）；

2. 尽快离心，使用1500 g，4 ℃离心10 min，收集上层血浆；

3. 将血浆冻存于-80 ℃（短时间可以暂存-20 ℃），干冰寄送至实验室。

实验方法：

1) 取20 μL 血浆并加入180 μL 的Binding Buffer；

2) 将PT-Plasma Beads 超声分散，并用移液枪吹打混匀，取100 μL PT-Plasma Beads 加入2）中，在1.5 mL EP 管中混匀并置于室温振荡30 min；

3) 12000 g 离心5 min 去上清，并依次加入500ul 的Washing Buffer（WB1/2/3）清洗3次，每次加入Washing Buffer 后混匀，并振荡5 min，之后12000 g 离心5min 去除上清，留沉淀进行后处理；

4) 方式一：向Lysis Buffer-1 中加入75 μL 的Lysis Buffer-2 和75μL 的Lysis Buffer-3，涡旋混匀，取其中50 μL 加入3）中沉淀，移液枪吹打混匀后置于95℃震荡10min;方式二：取40 uL 的Lysis Buffer-1 至3）中沉淀，将富集在beads 上的蛋白进行充分的溶解，之后加入5 μL 的Lysis Buffer-2 和5 μL 的Lysis Buffer-3，置于95 ℃震荡10 min；

5) 恢复常温后将样本置于37 ℃进行Beads 上酶解，酶解两次，第一次向4）中加入2.4μg Tripase，第二次加入1 μg Tripase，单次酶解时间至少2-4 h；

6) 向5）中加入50 μL Desorption Buffer-1 之后剧烈震荡并超声1 min，12000 g 离心10min 后取上清液转移至新的EP 管；并向沉淀中加入100 μL Desorption Buffer-2，剧烈震荡并超声1 min，12000 g 离心10 min 后取出上清液至上一步的新的EP 管中，即合并6）中两次上清液；

7) 使用SDB 柱除盐：首先向柱子中加入200 μL CWB-1，2000 g 离心5 min，弃离心下来的液体；然后向柱子中加入200 μL CWB-2，2000 g 离心5 min，弃离心下来的液体；再向柱子中加入6）中合并的上清液，2000 g 离心5 min，弃离心下来的液体；接下来向柱子中加入200 μL CWB-2，2000 g 离心5 min，弃离心下来的液体；最后向柱子中加入200 μL CWB-3，2000 g 离心5 min，收集离心下来的液体，将其抽干，上机备用；

8) 质谱检测使用DIA 的检测方法，对样本进行液谱联用分析，上样量为50% loading；

9）基于质谱检测得到的RAW 文件，进行使用DIANN软件进行数据库的检索，然后基于数据库搜索的结果进行蛋白鉴定，同时进行肽段、蛋白和母离子质量容差分布分析来评定质谱检测数据的质量。对鉴定到的蛋白进行常见功能数据库注释，包括GO 数据库和KEGG 数据库；接下来进行蛋白质的定量分析，包括鉴定到的蛋白质总体差异分析和差异蛋白的筛选；最后针对筛选出来的差异蛋白进行GO、KEGG 功能富集分析等一系列的差异蛋白功能分析。

5.病例资料收集：年龄、性别、BMI、癌症分期、既往病史、病灶大小及数量、ALT、AST、AFP、GGT、HBsAg、HBcAb、总胆红素。

6.统计学分析

① 通过差异表达倍数及变异度（FC 和 P）结合多维统计（相关性、功能、来源、通路等）分析每个分子的权重值(VIP)，pathway等筛选差异候选Biomarker；

② 通过对筛选的差异分子进行ROC、重要度（随机森林）等进行分析，进一步缩小筛选差异候选Biomarker范围；

③通过逻辑回归等对候选标志物进行进一步组合优化和测试；

④通过不同数据分析方式进一步验证生物标志物的适用性：

如：主成分分析（Principal Component Analysis，PCA），是一种掌握事物主要矛盾的统计分析方法，它可以从多元事物中解析出主要影响因素，揭示事物的本质，简化复杂的问题。可使用 PCA 分析方法分析在组间筛选出的差异蛋白是否可以很好的区分患病组和对照组（control，case组）；

散点图、箱线图分析候选Biomarker在组间的相对丰度，并采用T-Test分析其显著性，确认其在组间的差异性，进一步体现Biomarker的准确性；

⑤配合其他临床数据，如有随访数据（终点事件）等，评估Biomarker与临床指标之间的关系，进行风险预测；

（三）技术路线图：

（四)、创新点

蛋白组学是在后基因时代中一个很重要的内容。基因的主要功能是通过其表达产物蛋白质来完成。而蛋白质亦具有相对独立的修饰，转运和互间作用的能力，具有对外界因素反应的协调能力，其独特的自身活动规律。我们基于质谱蛋白组学的MRD监测，其研究的检测目标是蛋白质，可直接反映肿瘤相关信息，进而避免因遗传信息的传递过程中存在的许多调控环节，核酸水平变异距离决定肿瘤表型的蛋白距离较远，所导致的有较多不可调控问题。利用蛋白质组学所进行的MRD研究，不仅是基因组研究逻辑上延续，也是基因组生物学意义上的拓展与深化，是系统生物学研究的重要成部分。目前基于蛋白组学的标志物、发病机制及药物靶点等相关研究已广泛应用于各种恶性肿瘤，并显示出了强大的生命力。

附件：

21.doc

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