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色谱中的两种超载-UV超载和质量超载

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2024/10/17

液相色谱（LC）

在实际分析中，经常碰到UV超载和质量超载，那么质量超载后，浓度和峰面积还成线性吗？UV超载，质量就一定超载吗？

体积超载

在《现代液相色谱技术导论》第三版P35，给出了体积超载和质量超载的定义：“由于样品的进样体积或进样量太大而造成的分离度（或）保留时间的变化，分别称为体积超载或质量超载”，分别对应下图A和B：

乍看这个定义，很懵，甚至读第三次的时候，任然懵，说的是进样体积，本质是UV超载，为什么说体积超载？如果溶液浓度很稀，进样高体积（且无溶剂效应和质量超载），真的会出现图A这个情况吗？

实际实践了一下：配制某化合物5ug/mL，采用下表100*4.6mm*3um的色谱柱（临界体积为62.8uL），依次进样30uL，50uL，70uL，80uL，90uL，100uL，得到如下重叠图，除了保留时间稍微有点飘，没发现A图所说的结果.

各种规格色谱柱的临界进样体积计算公式：

书中给出了4种不同规格型号色谱柱的临界体积（上表中标红色的），其他为自己计算后加上，为什么没给出250*4.6mm 5um色谱柱的？计算结果显示该规格型号色谱柱的临界体积较大，分别为104.7uL和81.1uL，常用分析仪器进样体积也就1-100uL，体积超载概率太低。。

书中“2.6.1 条—体积超载样品体积对分离效果的影响”说完，都没指出体积超载就是UV超载（那是不是呢？就按照UV超载去理解吧），只有在“2.6.3.1 条”最后提到一句话“样品的最大进样浓度或者最大进样量W_max应该尽早确定，这样就能避免因为样品超载引起的问题，包括检测器超载引起非线性的检查结果”但不能让人和体积超载联系起来。

个人理解：书中所说的体积超载只是用来表征检测器（常用UV）超载的指针，UV超载呈现给我们最直观的就是色谱峰，那以什么指标去衡量UV超载？只有计算体积比较直观了，这也可能是作者采用体积超载来描述UV超载的原因吧。如果不对也尽请谅解。

质量超载

理解较容易，也不会有什么难点，色谱柱的最大柱容量给出如下公式：

最大柱容量和柱子长度无关，和色谱柱内径的平方成正比。

回到前言的问题：质量超载后，浓度和峰面积还成线性吗？

案例1

某化合物检测波长采用220nm，进样10uL，0.1mg/mL至100mg/mL范围内的线性方程如下：

结果显示，虽然质量超载严重，但浓度和峰面积仍然成线性，且截距百分百很小，说明UV无超载问题，为什么？紫外图显示，该化合物的最大吸收处于末端吸收，检测波长在220nm吸收平缓，且吸收不强，即使进样质量超载，化合物流经UV时，其紫外吸收尚未溢出，故仍然成线性。如果选择200nm作为检测波长，肯定不成线性；

案例2

某化合物，检测波长200nm，供试品浓度为10mg/mL，进样10uL，结果如下:

结果显示，质量和UV均超载，浓度大于3mg/mL以后已经不成线性，3mg/m以下，看起来R²较好，但是截距很大，响应因子一直呈降低趋势，可能是化合物响应太强，低浓度仍然处于UV超载，在加上操作误差综合导致.

质量不超载，检测波长处如果紫外吸收很强，则仍然会导致UV超载，不成线性，质量超载和UV超载，不存在必然的关系，关键还需要看化合物结构和所选择的检测波长；选择没有紫外吸收或紫外吸收很弱的波长做检测波长，那UV超载就比较困难。

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