反相色谱法一般是HPLC方法建立的一个默认选择,但其他色谱模式如正相色谱法(NPC)、亲水色谱(HILIC)、离子交换色谱(IEC)和体积排阻色谱(SEC)可能更适合某些样品。选择色谱模式时,需要考虑样品的化学和物理特性 。 1)反相色谱(RPC): a. 机理:基于分析物在疏水固定相和极性流动相之间的分配差异。固定相通常是C18或C8等烷基键合硅胶,流动相为甲醇、乙腈或含水相的缓冲液。b. 适用性:适用于分离非极性、极性或离子型化合物,是目前应用最广泛的色谱模式,特别适合分析小分子化合物。 c. 特点:分辨率高、平衡速度快,可改变流动相的组成和pH值来优化分离。 d. 注意事项:对于可离子化化合物,可添加离子对试剂的方式进行分析。 2)正相色谱(NPC): a. 机理:基于分析物在极性固定相上的吸附/解吸附过程。固定相通常是硅胶或氧化铝,流动相为非极性和弱极性溶剂,如正己烷、二氯甲烷等。 b. 适用性:适用于非极性与弱极性化合物的分离,如脂溶性维生素、甾体激素等。 c. 特点:在极性填料表面可能产生死吸附,导致重现性较差。 3)亲水色谱(HILIC): a. 机理:基于分析物在流动相与固定相表面富水层之间的分配差异。固定相为极性基团键合填料,流动相为含水的有机溶剂。 b. 适用性:特别适合极性化合物的分离,如糖、极性代谢物等。 c. 特点:有时被称为含水正相色谱,是高极性化合物分析的重要手段。 4)离子交换色谱(IEC): a. 机理:基于分析物所带电荷与离子交换剂上带相反电荷的基团之间的相互作用。 b. 适用性:适用于离子化化合物的分离,如氨基酸、蛋白质等。 c. 特点:离子交换剂可以是阴离子或阳离子交换剂,通过改变pH或离子强度实现分离。 5)体积排阻色谱(SEC): a. 机理:基于不同分子量组分在填料内的流经路径差异,实现分离。 b. 适用性:适用于大分子化合物的分子量测定和分布分析,如聚合物、蛋白质等。 c. 特点:通常不适用于小分子之间的分离,因为分辨率较低。 03.流动相的选择流动相的选择因素包括极性、pH、粘度和添加剂。根据样品的极性选择合适的溶剂或溶剂组合,调节流动相的pH值以适应样品组分的性质,选择低粘度流动相以利于分离,并在流动相中加入缓冲液或其他添加剂以增强分离效果 。 1)反相色谱:最常用的液相色谱模式,固定相通常是非极性的,而流动相多为水和有机溶剂的混合物。常用流动相溶剂包括水、甲醇(MeOH)和乙腈(ACN)。常用添加剂包括磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、甲酸或乙酸和三氟乙酸(TFA)。 2)正相色谱:多用于分离极性样品,固定相极性较高,流动相则使用非极性或弱极性溶剂。常用流动相溶剂包括己烷/异辛烷、二氯甲烷、乙酸乙酯和氯仿。添加剂包括异丙醇和酸碱调节剂。 3)离子交换色谱:通过离子交换基团的作用分离离子型样品。常用流动相溶剂与缓冲液包括磷酸盐、醋酸盐、硼酸盐等。有机溶剂如甲醇和乙腈可与缓冲液混合以增强洗脱能力。添加剂包括酸碱调节剂和离子对试剂。 4)尺寸排阻色谱:主要用于分离大分子物质,如蛋白质、多糖等。常用流动相溶剂包括水相缓冲液和有机溶剂。添加剂包括防腐剂和pH调节剂 。