兔脊髓成纤维细胞

原代培养原理和应用：

一、细胞原代培养是通过特殊分离方法从胚胎、组织器官以及外周血中分离获得单细胞，置于合适的培养基中培养，在无菌、适当温度和一定条件下，使细胞生存、生长和繁殖的过程。原代培养的“代”并非细胞的代数，是指细胞培养的次数，从体内取出组织接种培养到第一次传代的阶段，都属原代培养，一般持续1-4周。常见的原代培养过程如图1所示。

二、原代培养细胞直接来源于活体组织，体外培养也尽量模拟体内环境，使得分离得到的细胞接近生物体内的生活状态，可作为研究生物体细胞的生产、代谢、繁殖、凋亡提供有力手段，亦可用于各种药理作用、药物开发研究和临床实践。

三、原代细胞的质量取决于多个因素：取材、培养条件的优化、无菌操作，特别是组织分离技术等。对于大多数研究者而言，想要获得高质量的原代培养细胞仍然比较困难。尽管原代培养技术已较普遍，但是有时仍会得到一些难以解释的结果。拥有行政许可的洁净级实验动物中心，已构建细胞培养和实验平台，可分离培养数百种人、大小鼠和大型动物的原代细胞，并在此基础上提供相关细胞实验服务，包括细胞培养、细胞转染以及细胞药物刺激后各种增殖、侵染和凋亡实验。

兔脊髓成纤维细胞

培养信息：

培养基：含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等

换液频率：每2-3天换液一次

生长特性：贴壁

细胞形态：成纤维细胞样

传代特性：可传5代左右；3代以内状态最佳

消化液：0.25%胰蛋白酶

培养条件：气相：空气，95%；CO2，5%

兔脊髓成纤维细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

方法简介：

实验室分离的兔脊髓成纤维细胞采用胰蛋白酶-胶原酶混合酶消化后差速贴壁制备而来，细胞总量约为5×10⁵cells/瓶。

质量检测：

实验室分离的兔脊髓成纤维细胞经Vimentin免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

细胞简介：

兔脊髓成纤维细胞分离自脊髓组织；脊髓是细细的管束状的神经结构，位于脊柱的椎管内且被脊椎保护；是源自脑的中枢神经系统延伸部分。中枢神经系统的细胞依靠复杂的联系来处理传递信息。脊髓的主要功能是传送脑与外周之间的神经信息。人和脊椎动物中枢神经系统的一部分，在椎管里面，上端连接延髓，两旁发出成对的神经，分布到四肢、体壁和内脏。脊髓的内部有一个H形（蝴蝶型）灰质区，主要由神经细胞构成；在灰质区周围为白质区，主要由有髓神经纤维组成；脊髓是许多简单反射的中枢。脊髓两旁发出许多成对的神经（称为脊神经）分布到全身皮肤、肌肉和内脏器官。脊髓是周围神经与脑之间的通路，也是许多简单反射活动的低级中枢。按脊神经的出入可把脊髓也分为相应的31节，31对脊神经就是由不同的脊椎发出的。成纤维细胞（Fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞分化而来；成纤维细胞较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显。成纤维细胞功能活动旺盛，细胞质嗜弱碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动，在一定条件下，它可以实现跟纤维细胞的互相转化；成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损的修复有着十分重要的作用。刚分离的脊髓成纤维细胞呈圆形、折光性良好，悬浮于培养基中。30min细胞贴壁，其中部分开始伸出伪足，表现为小的突起；6h后细胞基本贴壁完全，伸展成梭形，胞核清晰，分布较均匀，散在生长，不聚集成团；细胞生长迅速，5-7天即呈融合状态，细胞排列紧密，有的交叉重叠生长，平坦、胞体较大，细胞质透明，细胞核较大，呈椭圆形，颜色淡。细胞融合，并彼此连接成网状；细胞呈突起的纺锤形或星形的扁平分布。脊髓成纤维细胞在生理条件下的主要功能包括：构造和维持组织的正常形态；合成和释放细胞外基质；组织损伤后及时大量聚集修复损伤组织。

贴壁细胞传代操作步骤：

用移液管或者巴氏吸管吸取培养液；

使用不含钙镁离子的平衡盐溶液（PBS）冲洗细胞1-2次；

弃PBS，加入胰蛋白酶-EDTA消化液（消化液浓度根据各细胞不同有调整），轻轻摇晃培养瓶，使胰酶与细胞表面充分接触，37 ℃孵育2-3 min，加入含血清完全培养基终止消化。

将细胞悬液移入离心管中，800 rpm-1000rpm离心5min，弃上清，加入预热的完全培养基重悬细胞，轻轻吸打混匀，吹打过程中尽量不要出现气泡。

细胞计数，根据细胞量选择合适的传代比例，最后转移置37 ℃细胞培养箱中进行培养。

 悬浮细胞传代操作步骤：

悬浮细胞由于本身在生长培养基中悬浮，无需通过酶的作用使其从培养容器表面脱离，整个过程较为迅速，对细胞损伤较小。悬浮细胞传代，通常有两种方法，直接传代法和离心传代法。

（1）直接传代法

①　悬浮细胞长满至80%-90%左右（细胞悬液变黄，最大细胞密度随细胞系不同而有所差异），即可传代；

②　用吸管吸弃细胞悬液1/2～2/3；

③　加入适量的新鲜培养基，继续培养。

（2）离心传代法

①　将细胞悬液转移到离心管内；

②　800 rpm-1000rpm离心5min，弃上清；

③　使用新鲜的培养基重悬细胞；

④　吸管吸取适量细胞悬液，装入新的培养瓶，再加入适量的新鲜培养基，继续培养。

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