神经细胞

体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。神经细胞培养的主要优点是:(1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能上的某些特点, 而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。(2)能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究。(3)易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学和生物因子（如神经营养因子）等实验条件, 观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。(4)便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制，药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影响。 我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作，取得了一些经验，现将培养细胞分类及方法简要介绍如下:一.鸡胚背根神经节组织块培养 主要用于神经生长因子（NGF）等神经营养因子的生物活性测定。在差倒置显微镜下观察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性。1． 材料和方法 （1）选正常受精的鸡蛋，置于37℃生化培养箱内孵化，每日翻动鸡蛋一次。 （2）取孵化8-12 d 的鸡蛋, 用70% 酒精消毒蛋壳，从气室端敲开蛋壳，用消毒镊剥除气室部蛋壳。（3）用弯镊钩住鸡胚颈部，无菌条件下取出鸡胚置小平皿内，除去头部后，腹侧向上置 灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔，除去内脏器官。（4）在解剖显微镜下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其两侧，在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧 排列的背根节（图1），用一对5号微解剖镊小心取出。（5）置背根节于解剖溶液内，用微解剖镊去除附带组织，接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料 培养瓶中，在DMEM无血清培养液中培养。2． 结果鸡胚背根神经节在含神经生长因子(NGF, 2.5S，20ng/ml)的无血清培养液中培养24 h,神经节长出密集的神经突起。而未加NGF的神经节培养24 h, 未见神经突起生长。二．新生大鼠、新生小鼠及鸡胚背根神经节分散细胞培养背根神经节（DRG）细胞起源于神经嵴，NGF研究先驱Levi-Montalcini的实验表明，外原性NGF能刺激DRG细胞生长发育并形成广泛的神经网络。在体外，分离培养的神经节在NGF存在的情况下，神经突起的生长在一天之内可长达数毫米，因此，利用培养的DRG细胞，进行轴突生长发育的研究，是最为经典而常用的方法之一。

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俄亥俄州哥伦布市一项新的研究表明，成熟脑细胞表面的三种特定蛋白量的增加可促使细胞产生新的生长延伸。该研究探讨了小鼠脑神经细胞上的三个相关的受体蛋白：GPR3，GPR6和GPR12。当研究人员增加这三种蛋白的量后，细胞生长延伸比蛋白水平正常时的神经细胞的生长大三倍，延伸速度比对照细胞快4-8倍。俄亥俄州立大学医学中心的项目主持人Yoshinaga Saeki说，“我们的研究结果显示，这三种蛋白可能是用于治疗中风、脑和脊髓损伤及神经退行性疾病的重要靶点。”该研究刊登在4月6日的《生物化学杂志》（Journal of Biological Chemistry）上。 这些蛋白量的增加与神经细胞cAMP内的一种重要的信号分子的水平的增加有关。这个分子在调控神经细胞生长、分化和生存，以及传输神经冲动的轴突再生中起着关键作用。随着哺乳动物神经细胞的成熟，其细胞内的cAMP水平下降，这可以部分解释为什么成熟神经细胞受损的轴突不能再生。神经外科副教授、俄亥俄州州立dardinger神经肿瘤及神经科学实验室主管Saeki声称，“我们的发现为cAMP在轴突生长中起着重要作用这一观点提供了更多证据，并显示出这些受体蛋白可能在调节神经细胞cAMP的产生中起主要作用。” 该研究的第一作者Shigeru Tanaka是Saeki所在实验室的一名博士后研究员。在本项研究中，他与同事从小鼠与大鼠脑组织神经母细胞瘤中取得神经细胞，使之在培养基中生长以了解更多关于这三种蛋白及其调控cAMP生长中的作用。他们向这些细胞中注入三种基因以增加这三种蛋白的含量水平，然后用一种被称为核糖核酸干扰的实验室技术关闭这三种蛋白的产生。上述三个蛋白分子中GPR3在神经细胞中最为丰富，而GPR12刺激神经细胞延伸的作用最强。研究表明，阻断GPR3的产生会大大减慢神经细胞的生长速度，研究者们通过修复GPR3或GPR12的产生扭转了这种效应。三种蛋白质的含量水平高也与较高水平的cAMP有关，同时GPR6和GPR12能增加两倍到三倍的水平。 Saeki说，“总的来说，我们的研究结果显示，这三种蛋白能加快神经细胞的生长即使在抑制分子的存在下也是如此，我们迫切希望能找出可以在临床前中风或脊髓损伤动物模型身上重现此结果的方法。”来源：生物谷