新分子技术

近日，河南省首个高等院校协同创新中心——分子诊断技术协同创新中心在商丘师范学院揭牌成立。 　　据了解，该协同中心由商丘师范学院化学化工学院生物分子识别与传感重点实验室牵头，上海曼克尔瑞生物医药技术有限公司，商丘市第一、三人民医院和商丘市中心医院等5家单位组成。成立后的协同创新中心，将对于服务社会、提高人民健康水平和开展肿瘤易感人群的早期筛查、推广肿瘤病人的个体化治疗，以及打造“产学研用结合”的示范基地具有重要作用。

为帮助科研工作者了解前沿分子互作分析技术，向用户传递准确、实用的技术干货和宝贵的实验经验。本期，仪器信息网特别邀请到中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）吴萌高级工程师谈一谈分子间相互作用定量分析技术及案例分享。中科院分子细胞科学卓越创新中心 吴萌 高级工程师现就职于中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）分子生物学技术平台，负责生物分子相互作用相关检测仪器管理，主要从事分子互作技术服务、平台仪器管理、用户使用培训及相关工作。深耕生物分子互作技术领域近十年，积累了大量相关经验，为科研工作者论文发表提供高质量的技术服务支持。探究生物分子间相互作用，可以从分子水平上揭示生物体各项生理机能,为探讨疾病的治疗和预防提供理论依据，对研究生命活动的规律有重要指导意义。近年来，可用于定量检测分子间相互作用的新型技术因其无需标记、实时表征且检测快速等特点而迅速发展，应用广泛。本文选取其中比较有代表性的四种技术，分别是等温滴定微量热(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)、微量热泳动(MicroScale Thermophoresis, MST)、表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance, SPR)和生物膜干涉(Bio-Layer Interferometry, BLI)，围绕其技术特点进行介绍并分享几则研究案例。ITC、MST、SPR及BLI技术解析ITC技术可直接检测生物分子结合过程中的热量改变。实验时，保持仪器样品池和参比池温度相同，通过加热补偿原理检测体系热量变化，从而得到生物分子的结合信息。其最大特点在于样品在溶液内即可完成检测，且无需任何标记，单次实验即可测定亲和力常数及热力学常数。MST技术是测量溶液中分子环境的改变，如水化层、电荷等特性变化而导致的微量热改变，从而确定亲和力大小的。该技术优点在于仪器灵敏度高，分子结构或者构象上的微小改变都可以检测到，且不受样品分子量限制。MST在溶液中即可完成检测，样品不需要固定在一个表面。SPR技术则通过将一个分子固定在传感芯片表面的形式，将另一分子以溶液形式连续流过芯片，检测器可以实时检测到溶液中分子与芯片表面分子的结合、解离过程。SPR通过实时记录传感器芯片表面分子质量变化，实时监测分子间相互作用信息。BLI技术也是一种光学分析技术（原理类似SPR技术），检测的是生物传感器上固定的生物分子表面层厚度的变化。若待测分子与生物传感器尖端的固定相分子发生结合，其数量的变化可致实时测定的干涉图谱发生相应改变，进而得到分子间相互作用信息。SPR和BLI技术均可实时检测到结合过程和解离过程，因此不仅可以提供亲和力信息，还可以提供结合常数和解离常数等动力学信息。相比于免疫共沉淀、融合蛋白沉降等传统检测技术，以上四种技术具有所需样品量少、实验时间短、结果重复性好、假阳性低等特点，在生物分子相互作用检测中具有很大的优势，在蛋白质组学、细胞信号传导、疫苗和抗体药物研发、药物筛选及抗生素快速检测等多个领域应用广泛。本文分享几则不同科研领域的研究案例，希望为大家仪器应用方案拓宽思路。应用案例分享案例一：核酸适配体(Aptamer)通常是利用体外筛选技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段，能与相应的配体进行高亲和力和强特异性的结合。复旦大学附属眼耳鼻喉科医院的吴继红课题组[1]通过体外筛选技术筛选疾病生物标志物特异性结合的核酸适配体后，运用BLI和ITC等技术分析核酸适配体序列与靶分子之间的相互作用。优选动力学和热力学性能较好的核酸适配体序列进行优化和改造，通过BLI技术检测，获得最佳性能的核酸适配体序列，并建立了基于核酸适配体的快速检测疾病生物标志物的新方法。BLI技术进行核酸适配体的筛选及验证案例二：介孔二氧化硅纳米颗粒(Mesoporous silicana noparticles，MSNs)作为新一代纳米材料的代表，被认为是最有希望用于临床应用的药物载体。但目前大部分研究集中于MSNs的功能化设计上，其非功能化的固有生物学效应研究报道较少。上海交通大学医学院公共卫生学院王慧教授[2]等人通过对机制的研究，发现MSNs能够靶向肿瘤组织中巨噬细胞。运用MST技术检测到MSNs可直接作用于巨噬细胞表面TLR4受体。通过联合PD-1抗体，MSNs能够在治疗早期，快速地建立了T细胞炎症性的肿瘤微环境，从而克服肿瘤对PD-1抗体的耐药性。该研究为MSNs在肿瘤免疫治疗中的潜在应用提供了理论基础，为进一步开发新型纳米药物提供了科学依据。MST技术检测FITC-MSNs与TLR4蛋白的亲和力案例三：雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)是感受营养与应激信号调节细胞生长与代谢的中心调控分子。中国科学院分子细胞科学卓越创新中心研究员丁建平研究员[3]等人研究揭示了SAMTOR作为一个S-腺苷甲硫氨酸(SAM)传感器，通过感知SAM以调控mTORC1活性的分子机制。该研究工作中，通过ITC技术测定了黑腹果蝇源SAMTOR(dSAMTOR)的MTase结构域与SAM和SAH的相互作用，进一步对激活mTORC1活性的功能开展深入研究。ITC技术检测SAM和SAH与dSAMTOR的亲和力案例四和案例五：蛋白-化合物亲和力测定蛋白和小分子化合物间的相互作用检测，经常受限于化合物的溶解性及分子量过小等因素，难以得到准确的亲和力信息。往往需要实验人员通过对测试条件，如缓冲液条件、传感器灵敏度、样品标记手段等改善和优化最终获得高质量的数据。中国科学院分子细胞科学卓越创新中心杨巍维研究员[4]等人运用SPR技术检测了重组SSRP1蛋白和糖酵解代谢物-丙酮酸(pyruvate, 分子量仅为88.06Da)的相互作用，成功得到二者之间的亲和力常数为280μMol，进而从机制上解释了丙酮酸在肿瘤DNA损伤应答(DNA damage response, DDR)中的新功能。上海交通大学医学院王宏林教授[5]等人利用生物素标记的AKBA固定到生物传感器上，通过BLI技术检测到AKBA可直接作用于甲硫氨酸腺苷转移酶IIα( MethionineAdenosyltransferase2A, MAT2A)。以上所分享的研究工作中，分子间相互作用的数据均在中科院分子细胞科学卓越创新中心的分子生物学技术平台的ITC、MST、BLI仪器和化学生物学技术平台的SPR仪器上完成的。分子生物学技术平台隶属于中国科学院分子细胞科学卓越创新中心的公共技术中心，是分子生物学国家重点实验室的主要技术平台。平台目前拥有蛋白质稳定性分析仪、差示扫描量热仪等可用于蛋白质质控、稳定性条件筛选等测试，同时拥有ITC、MST、BLI、SPR四台仪器，用于分子间相互作用的定量检测。经过近十年的发展和实验经验的积累，我们针对不同的样品体系进行归类，建立了成熟的检测方案，可以为科研及工业用户提供高质量的技术服务支撑。 参考文献：[1] Gao S., Zheng X., Teng Y, et al. Development of a fluorescently labeled aptamer structure- switching sssay for sensitive and rapid detection of gliotoxin. Analytical Chemistry. 2019,91 (2): 1610-1618[2] Sun M, Gu P, Yang Y, et al. Mesoporous silica nanoparticles inflame tumors to overcome anti-PD-1 resistance through TLR4-NFκB axis. Journal for Immuno Therapy of Cancer, 2021, 9: e002508[3] Tang X, Zhang Y, Wang G, et al. Molecular mechanism of S-adenosylmethionine sensing by SAMTOR in mTORC1 signaling. Sci Adv. 2022 Jul 8(26):eabn3868[4] Wu S, Cao R, Tao B, Wu P, et.al. Pyruvate facilitates FACT-mediated γH2AX loading to chromatin and promotes the radiation resistance of glioblastoma. Adv Sci (Weinh). 2022 Mar, 9(8): e2104055[5] Bai, J., Gao, Y., Chen, L. et al. Identification of a natural inhibitor of methionine adenosyl transferase 2A regulating one-carbon metabolism in keratinocytes. E Bio Medicine, Volume 39, 2019, Pages 575-590

中国科学技术大学研究人员领衔的一个团队最近利用钻石中的一种特殊结构做探针，首次在室内温度空气条件下获得单个蛋白质分子的磁共振谱。该成果使利用基于钻石的高分辨率纳米磁共振成像诊断成为可能。 　　这一发现5日发表在新一期美国《科学》杂志上。负责该研究的中国科学技术大学教授杜江峰说，通用的磁共振技术已被广泛用于基础研究和医学应用等多个领域，但其研究对象通常为数十亿个分子，单个分子独特的信息无法观测。基于钻石的新型磁共振技术在继承传统磁共振优势的同时，将研究对象推进到单个分子，成像分辨率由毫米级提升至纳米级，但其主要难点是源自单分子的信号太弱。 　　为此，杜江峰的团队利用碳-12富集的钻石为载体，注入氮离子使其产生一种名为&ldquo 氮-空位点缺陷&rdquo 的结构，并使该结构发挥探针作用，在纳米尺度上靠近被探测的蛋白质。此外，他们利用一种名为&ldquo 多聚赖氨酸&rdquo 的物质保护蛋白质，确保其在研究过程中的稳定性。 　　研究人员选取了细胞分裂中的一种重要蛋白质MAD2为研究对象。经过两年多的努力和逾百次尝试，最终他们成功在室内温度及空气条件下首次获取了单个蛋白质分子的磁共振谱，并通过谱形分析，获取了其动力学性质。 　　关于这项技术的用途，杜江峰表示，最直接的用途是在不影响蛋白质性质的前提下检测其结构和动力学性质，直接在细胞膜上或细胞内研究蛋白质分子，&ldquo 这对生命科学研究来说有极大吸引力&rdquo 。 　　总之，该技术拓宽了单个分子领域的研究范围，在分析化学、结构生物学、高分子、磁性材料等领域具有重要应用前景和实用价值。以此为基础，结合扫描探针、高梯度磁场等技术，未来可将该探测技术用于生命及材料领域的单个分子成像、结构解析、动力学监测，甚至直接深入细胞内部进行微观磁共振研究，为获得科学新发现孕育可能。 　　《科学》杂志的审稿人评价该工作是&ldquo 单个蛋白质分子检测的突破性成果&rdquo ，开启了利用&ldquo 氮-空位点缺陷&rdquo 进一步研究&ldquo 自旋标记&rdquo 蛋白质的可能，有重要应用前景。参与这项研究的还有来自中国科学院强磁场科学中心和德国斯图加特大学的研究人员。 　　原文检索：Single-protein spin resonance spectroscopy under ambient conditions