蛋白质测序

前文回顾（点击查看）：蛋白质测序技术发展漫谈（上篇）；蛋白质测序技术发展漫谈（中篇）；蛋白质测序技术发展漫谈（下篇）前面描述了目前成熟的蛋白质测序方法，并对最流行的基于质谱的蛋白质测序方法进行了综述。非质谱依赖的蛋白质测序手段，除了几十年前发展的基于Edman降解法通过气相或液相色谱测序的方法，最近热门领域的方法主要包括基于荧光或纳米孔的单分子蛋白质测序，代表了未来的发展方向。基于纳米孔单分子蛋白质测序方法纳米孔测序（nanopore sequencing）法是借助电泳驱动力使待测单个分子逐一通过纳米孔，通过检测纳米孔截面的电流变化来实现对序列的测定。纳米孔测序最初在1996年被提出，通过膜通道检测多核苷酸序列，也就是单分子DNA的测序[1]。随着使用纳米孔对单分子DNA测序技术的逐渐成熟[2-5]，纳米孔技术也被应用在单分子蛋白质的鉴定上。对于DNA来说，其二级结构和电荷相对比较一致，它的聚合物比较容易处理，而且仅由四种碱基组成，单分子DNA测序比较简单。相比之下，蛋白质分子由20种氨基酸组成，并且蛋白的电荷和疏水性多变，还存在大量的二级和三级结构，因此基于纳米孔技术对蛋白质的鉴定要比DNA困难很多[6]。当前的基于纳米孔对蛋白质分析的主要探索方向是通过寡核苷酸适配子或抗体等亲和分子对纳米孔进行功能化，当蛋白质或肽段分子通过纳米孔时，由于不同氨基酸在纳米孔附近的结合或通过会引起不同幅度的电流变化，基于这些变化就可以确定氨基酸的种类，从而逐个得到所测蛋白质或肽段的序列信息（图1）。图 1 借助纳米孔的横向电流检测单分子蛋白质[2]牛津大学的Hagan Bayley[7]团队将单个α-血溶素蛋白孔插入两侧带有电极的膜中，磷酸化的蛋白质在DNA寡核苷酸的牵引下展开，并穿过纳米孔，通过记录纳米孔的电流变化区分出了202个磷酸化蛋白质的4种不同亚型，但无法鉴定蛋白质的一级结构。Francesco[8]团队将蛋白质或氨基酸吸附在金纳米星上，并施加电等离子体力将粒子推进并约束在金纳米孔内，利用金纳米星与金纳米孔壁之间的单个热点，实现了单分子表面增强拉曼散射（SERS）探测，用于检测氨基酸，并且可以分辨仅含有两个不同氨基酸的单个多肽分子抗利尿激素和催产素。Cao等[9]通过单个定点突变，在具有锥形识别位点的耻垢分枝杆菌孔蛋白A（MspA）的纳米孔内腔中引入了甲硫氨酸，从而将该反应有目的的移植到了MspA纳米孔最尖锐的识别位点，并观测到了相应的单分子反应信号。该纳米孔可以引入更多的离子电流，从而放大检测信号，其狭窄的识别位点则提供了更高的空间分辨率，大大削弱了周围氨基酸的干扰，从而拓宽生物纳米孔的单分子检测功能，有望推进基于孔道的单分子蛋白质测序研究。Ouldali[10]研究团队研发出了一种新型气溶素纳米孔，此纳米孔借助将氨基酸附着在聚阳离子载体上，使氨基酸在纳米孔上停留时间变长，并检测其通过纳米孔时电流的变化，最终可识别出组成蛋白质的15种氨基酸，也能检测到组成蛋白质的其余5种氨基酸的电流变化，但是无法对其进行区分。虽然只是对氨基酸进行识别，但作者设想通过对蛋白或者肽段末端氨基酸逐个降解，利用纳米孔技术鉴定从末端释放出来的氨基酸，从而对蛋白质或肽段序列进行测定。Zhao[11]等将一对金属电极分隔在约2nm的孔洞旁，当氨基酸线性穿过这种纳米孔的时候，每一个氨基酸都会完成一个回路，并反馈出相应的电信号，常见的20种氨基酸在通过纳米孔时都可以产生电信号。有的氨基酸需通过大约50种不同信号特征被鉴定，但绝大多数的氨基酸仅需要不到10个信号特征被鉴别。这种方法不仅能够高可信度的鉴定氨基酸，还能区分翻译后修饰的氨基酸（肌氨酸）及其前体（甘氨酸）、区分同分异构体的亮氨酸与异亮氨酸、区分对应对映异构体的氨基酸镜像分子L-天冬酰胺和D-天冬酰胺。此技术被应用于对两条由四个氨基酸组成的短肽（GGGG 和GGLL）进行测序，单分子短肽穿过纳米孔，孔道两边电极记录每个氨基酸通过时产生的电信号，通过测序算法，识别代表不同氨基酸的特征信号，从而得到短肽的序列。基于纳米孔单分子蛋白测序目前还属于初步发展阶段，除了需要根据电信号准确区分组成蛋白质的氨基酸以外，另一个关键是设计可一次拉动一个蛋白质或氨基酸穿过纳米孔的“马达”。为了让蛋白质或肽段顺利穿过纳米孔，研究者们在蛋白质一端添加了一串带有负电的氨基酸或者一段短DNA，用氨基酸或DNA链拉动蛋白质，可以使一些蛋白质打开折叠并顺利穿过纳米孔，但另一些复杂折叠的蛋白需要更多拉力，于是研究者在引导序列上添加了可以打开折叠的ClpX的识别位点[12]。这个系统能够将简单折叠的目标蛋白牵引过纳米孔，但对于折叠非常紧密的蛋白质仍要使用变性剂来打开折叠。基于纳米孔技术对单分子肽段或蛋白质测序目前还停留在对氨基酸鉴定和对短肽的区分阶段，还不能实际应用于对蛋白质的测序。虽然纳米孔测序具有高通量、对样品需求量少的优点，但是现有的纳米孔过大，失去了对氨基酸的区分能力，同时蛋白质分子通过孔道过快，加大了对信号读取难度；其次由于需要将蛋白的三级和二级结构破坏掉，纳米孔道需要能够耐受非常苛刻的化学和力学条件；第三，由于蛋白带电不均匀，控制其穿孔的速率也非常困难。所以目前的方法还不能准确的测得蛋白质的序列，基于纳米孔的单分子蛋白质测序技术还有很大的发展空间。基于荧光的单分子蛋白质测序方法基于荧光的单分子蛋白质测序同纳米孔测序一样，都可以对极少量蛋白质样品进行检测，其原理是先将蛋白质酶解成肽段，对肽段中特定氨基酸选择性标记不同的荧光基团[13]，对不同氨基酸上的荧光进行观察，从而确定肽段部分氨基酸序列，再将这些序列与蛋白质组序列比对，即可确定肽段的来源蛋白（图2）。图 2 基于荧光的单分子蛋白测序流程[14]。Ginkel[15] 和Yao [16]都利用ClpXP蛋白酶辅助对肽段进行选择性荧光标记，可对序列中的赖氨酸和半胱氨酸进行标记，通过Förster共振能量转移依次读出被标记的肽段的氨基酸的信号。Swaminathan[14] 将蛋白质酶解成肽段，再将肽段固载到玻璃片上[17]，使用特定荧光基团分别对肽段中的赖氨酸和半胱氨酸选择性标记，通过Edman降解技术对固载的肽段进行降解，每次降解后都使用全内反射荧光（TIPF）显微镜进行观测。如果被标记的赖氨酸和半胱氨酸在Edman降解中从肽段N端释放出来，被标记的以上两种氨基酸的位置就会被检测到。同时还发展了用于监测单个肽荧光强度的图像处理算法，并对误差源进行分类和建模，可以测得序列中部分氨基酸的信息。将测得的部分序列与参考蛋白质组序列比对，即可确定肽段的来源蛋白，通过与蛋白质组序列比对，可以鉴定到在人源蛋白质组中的绝大多数蛋白质。基于荧光单分子蛋白测序技术主要有三方面难点，一方面在于目前仅能对赖氨酸和半胱氨酸等几种氨基酸进行特异性荧光基团的标记，无法对所有氨基酸都进行标记；第二个难点是Edman降解是在强酸或强碱的环境中进行，对这些荧光基团的稳定性要求很高；第三个难点是对后期图像处理有较高的要求，如果序列中每个氨基酸都标记上不同的荧光基团，且发光峰易交叠难分辨，这给荧光处理算法带来了难度。因此，基于荧光的单分子蛋白测序技术虽然可以对极微量蛋白质样品分析，但目前仅能测得部分氨基酸序列，对蛋白质全序列的测定目前尚不能实现。[1] Kasianowicz J J, Brandin E, Branton D, et al. Characterization of individual polynucleotide molecules using a membrane channel [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1996, 93(24): 13770-13773.[2] Branton D, Deamer D W, Marziali A, et al. The potential and challenges of nanopore sequencing [J]. Nanoscience and technology: A collection of reviews from Nature Journals, 2010: 261-268.[3] Laver T, Harrison J, O’neill P, et al. Assessing the performance of the oxford nanopore technologies minion [J]. Biomolecular detection and quantification, 2015, 3: 1-8.[4] Karlsson E, Lärkeryd A, Sjödin A, et al. Scaffolding of a bacterial genome using MinION nanopore sequencing [J]. Sci Rep, 2015, 5(1): 1-8.[5] Huang S, Romero-Ruiz M, Castell O K,et al. High-throughput optical sensing of nucleic acids in a nanopore array [J]. Nature nanotechnology, 2015, 10(11): 986-991.[6] Nivala J, Marks D B, Akeson M. Unfoldase-mediated protein translocation through an α-hemolysin nanopore [J]. Nat Biotechnol, 2013, 31(3): 247-250.[7] Rosen C B, Rodriguez-Larrea D, Bayley H. Single-molecule site-specific detection of protein phosphorylation with a nanopore [J]. Nat Biotechnol, 2014, 32(2): 179.[8] Huang J, Mousavi M, Giovannini G, et al. Multiplexed Discrimination of Single Amino Acid Residues in Polypeptides in a Single SERS Hot Spot [J]. Angewandte Chemie 2020, 59(28): 11423-11431.[9] Cao J, Jia W, Zhang J, et al. Giant single molecule chemistry events observed from a tetrachloroaurate (III) embedded Mycobacterium smegmatis porin A nanopore [J]. Nature communications, 2019, 10(1): 1-11.[10] Ouldali H, Sarthak K, Ensslen T, et al. Electrical recognition of the twenty proteinogenic amino acids using an aerolysin nanopore [J]. Nat Biotechnol, 2020, 38(2): 176-181.[11] Zhao Y, Ashcroft B, Zhang P, et al. Single-molecule spectroscopy of amino acids and peptides by recognition tunnelling [J]. Nature nanotechnology, 2014, 9(6): 466-473.[12] Nivala J, Mulroney L, Luan Q, et al. Unfolding and Translocation of Proteins Through an Alpha-Hemolysin Nanopore by ClpXP [M]. Nanopore Technology. Springer. 2021: 145-155.[13] Hernandez E T, Swaminathan J, Marcotte E M, et al. Solution-phase and solid-phase sequential, selective modification of side chains in KDYWEC and KDYWE as models for usage in single-molecule protein sequencing [J]. New J Chem, 2017: 462-469.[14] Swaminathan J, Boulgakov A, Hernandez E, et al. Highly parallel single-molecule identification of proteins in zeptomole-scale mixtures [J]. Nat Biotechnol, 2018, 36(11): 1076-1082.[15] Ginkel J V, Filius M, Szczepaniak M, et al. Single-molecule peptide fingerprinting [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2018, 115(13): 3338-3343.[16] Yao Y, Docter M, Ginkel JV, et al. Single-molecule protein sequencing through fingerprinting: computational assessment [J]. Phys Biol, 2015, 12(5): 055033.[17] Howard C, Floyd B, Bardo A, et al. Solid-Phase Peptide Capture and Release for Bulk and Single-Molecule Proteomics [J]. ACS Chem Biol, 2020, 15(6): 1401-1407.作者简介：中国科学院大连化学物理研究所 单亦初副研究员1997年于中国科学技术大学获理学学士学位。2002年于中国科学院大连化物所获理学博士学位。2002年10月至2009年5月在德国马普协会马格德堡研究所、美国德克萨斯大学医学院及澳大利亚弗林德斯大学工作。2009年7月应聘到中国科学院大连化物所任副研究员。主持多项研究课题，包括国家重点研发计划子课题、国家自然科学基金面上项目等。已在Analytical Chemistry、Journal of Proteome Research、Journal of Chromatography A等杂志发表论文近80篇。主要研究方向包括蛋白质组鉴定和蛋白质组相对及绝对定量、蛋白质翻译后修饰富集和鉴定、蛋白质组末端肽富集和鉴定、蛋白质相互作用分析、蛋白质全序列从头测定及药物靶蛋白筛选。（本文经授权发布,仅供读者学习参考）专家约稿招募：若您有生命科学相关研究、技术、应用、经验等愿意以约稿形式共享，欢迎邮件投稿或沟通（邮箱：liuld@instrument.com.cn ）。

本期中国科学院大连化物所单亦初老师将分享蛋白质测序技术的发展，本次分享将以连载形式以飨读者。蛋白质一级结构是组成蛋白质的氨基酸序列。蛋白氨基酸序列分析是确定蛋白质全部氨基酸序列的过程。通过蛋白质测序获得的信息有许多用途，包括：蛋白质的鉴定；合成可用作免疫原的肽段；用于治疗的抗体仿制产品的研发；以市场上销售的抗体试剂为基础进行抗体药物研发。目前的蛋白质测序方法主要分为三类：基于PCR扩增的蛋白质测序、Edman降解测序以及基于质谱的蛋白质测序。基于PCR扩增的蛋白质测序是利用细胞中表达的DNA或者RNA进行基因测序，然后再按照氨基酸密码子表转换为蛋白质的氨基酸序列，本质上属于基因测序技术。Edman降解测序是较早发展的蛋白质测序技术，利用化学方法从蛋白质的N端将氨基酸依次降解，再使用高效液相色谱对氨基酸进行鉴定。但是这种方法只能用于鉴定蛋白质和多肽的N-末端氨基酸残基（通常是几个-十几个残基，最多不超过四十个残基），无法对大的蛋白质进行全序列测定。此外，Edman降解法也有一定的局限，例如N末端封闭或有化学修饰的情况下将不能使用Edman降解法对蛋白质序列进行分析。目前使用最广的蛋白质测序方法是质谱法，较Edman降解法而言，其优点在于，质谱法更敏感，可以更快地裂解肽，可以识别末端封闭或修饰的蛋白质。基于质谱的蛋白质测序策略可分为两大类：自上而下策略（Top-Down）和自下而上（Bottom-Up）策略。自上而下的策略无需对蛋白质进行降解，直接使用LC-MS对完整蛋白质进行分析，根据谱图中碎片离子确定其序列；自下而上策略是先将蛋白质水解成肽段，通过LC-MS对肽段检测，再对肽段从头测序以及序列拼接从而得到完整蛋白质序列。图 ：蛋白质序列测定原理Kira Vyatkina[1]通过自上而下的策略发展了一种Twister测序算法对单克隆抗体测序，虽然不需要使用蛋白酶酶解，减少了蛋白质预处理的步骤，但仅可以鉴定到抗体的序列片段。Liu[2]结合自上而下和自下而上两种策略发展了TBNovo测序算法对蛋白质进行测序，将自上而下的质谱数据作为抗体序列的骨架，再将胰蛋白酶酶解肽段的质谱数据对骨架的序列进行补充覆盖。由于特异性蛋白酶酶解后肽段种类少、覆盖率低，对抗体的轻链和CAH2区的测序覆盖率为86.9%和75.2%。Sen[3]发展了一种基于同源数据库搜索与从头测序结合的Supernovo测序算法，通过4种蛋白酶对单克隆抗体分别酶解，该测序方法仅可实现对抗体重链的可变区测序，无法对抗体全序列进行测定。Savidor[4]发展了一种蛋白质全序列从头测序的方法。将蛋白质在微波辅助下快速酸解，得到了种类丰富的肽段，使用其发展的肽段序列拼接算法——“肽段标签组装”（Peptide Tag Assembler，PTA），对从头测序的肽段进行序列拼接，但由于酸解的消化方式会使谷氨酰胺和天冬酰胺发生脱酰胺化，分别变为谷氨酸和天冬氨酸，降低了对蛋白质序列测定的准确度。为了解决蛋白质测序覆盖度低、准确度低的问题，我们发展了一种蛋白质全序列测定新方法[5]：该方法使用多种非特异性蛋白酶对蛋白质连续酶解，提高蛋白质酶解肽段种类和重叠度，从而提高蛋白质测序的覆盖度；此外，发展了一种序列拼接算法，根据从头测序得到的肽段序列中每个氨基酸的得分值和出现次数，对蛋白质序列进行组装和拼接，显著提高了蛋白质全序列测定的准确度。利用该测序方法对牛血清白蛋白的多种非特异性蛋白酶酶解后的肽段序列进行测序和拼接，实现了对牛血清白蛋白全序列100%准确度的测定。此外，将该方法应用于对乳腺癌药物单克隆抗体赫赛汀的全序列测定，重链和轻链的测序准确度分别达到99.6%和100%。参考文献[1] K V. De Novo Sequencing of Top-Down Tandem Mass Spectra: A Next Step towards Retrieving a Complete Protein Sequence [J]. Proteomes, 2017, 5(1), https://doi.org/10.3390/proteomes5010006[2] LIU X, DEKKER L J M, WU S, et al. De novo protein sequencing by combining top-down and bottom-up tandem mass spectra [J]. J Proteome Res, 2014,13(7): 3241-3248.[3] KI S, WH T, S N, et al. Automated Antibody De Novo Sequencing and Its Utility in Biopharmaceutical Discovery [J]. J Am Soc Mass Spectrom, 2017, 28(5): 803-810.[4] SAVIDOR A, BARZILAY R, ELINGER D, et al. Database-independent Protein Sequencing (DiPS) Enables Full-length de Novo Protein and Antibody Sequence Determination [J]. Mol Cell Proteomics, 2017, 16(6): 1151-1161.[5]杨超，单亦初，张玮杰等，基于非特异性蛋白酶连续酶解的蛋白质全序列测定方法，化学学报，修稿中。作者简介：中国科学院大连化学物理研究所 单亦初副研究员1997年于中国科学技术大学获理学学士学位。2002年于中国科学院大连化物所获理学博士学位。2002年10月至2009年5月在德国马普协会马格德堡研究所、美国德克萨斯大学医学院及澳大利亚弗林德斯大学工作。2009年7月应聘到中国科学院大连化物所任副研究员。主持多项研究课题，包括国家重点研发计划子课题、国家自然科学基金面上项目等。已在Analytical Chemistry、Journal of Proteome Research、Journal of Chromatography A等杂志发表论文近80篇。主要研究方向包括蛋白质组鉴定和蛋白质组相对及绝对定量、蛋白质翻译后修饰富集和鉴定、蛋白质组末端肽富集和鉴定、蛋白质相互作用分析、蛋白质全序列从头测定及药物靶蛋白筛选。（本文经授权发布,仅供读者学习参考）专家约稿招募：若您有生命科学相关研究、技术、应用、经验等愿意以约稿形式共享，欢迎邮件投稿或沟通（邮箱：liuld@instrument.com.cn）。

导读：自今年1月份Illumina让&ldquo 1000美元基因组&rdquo 成为现实，许多生物技术公司及科研机构纷纷购买其测序仪，而今美研究者指出DNA编码的蛋白质是几乎所有生命过程的主要执行者，可实现千元基因组测序的工具，也可以最终帮助人们完成千元蛋白质组测序。 人类生命的蓝图是三十亿碱基对组成的人类基因组。1000美元基因组测序，让人都觉得有些疯狂，然而有研究者认为千元测序蛋白质组也将成为现实。 今年初，全美最大最佳的五所&ldquo 大学城&rdquo 之一拥有近130年历史的Arizona State University（亚利桑纳州立大学）生物 设计学院（ Biodesign Institute）的Stuart Lindsay及其团队同事，在纳米孔DNA测序技术的基础上，让单链肽段穿过纳米孔，纳米孔两边的电极可记录每个氨基酸通过时产生的电信号。他们使用一种机器学习算法，让电脑能够识别代表不同氨基酸的特征信号。这些信号可以作为可靠的指纹，帮助人们鉴别氨基酸的种类，以及氨基酸发生的微妙改变。因此开发了能够精确鉴定氨基酸的蛋白单分子测序技术。 这项研究于四月六日发表在Nature Nanotechnology杂志的网站上。 从基因组到蛋白组 蛋白对于细胞的生长、分化和修复至关重要，它们能够催化化学反应，抵御疾病，具有各种各样的重要功能。自今年1月份Illumina让&ldquo 1000美元基因组&rdquo 成为现实，研究者们将眼光转向了蛋白质组测序的研究。 与线虫等简单生物相比，人类的基因数相对较少，不过科学家们鉴定的人类蛋白已经超过了十万，而且不少人认为这些蛋白只是冰山一角。有限的基因数为何能形成如此大量的蛋白呢？这是因为蛋白能通过多种机制发生改变，选择性剪切和翻译后修饰就是其中两个关键的过程。 在这项研究中，研究人员将一对金属电极分隔在约两纳米的孔洞旁边，当线性穿过这种纳米孔的时候，每一个氨基酸都会完成一个电回路，并发出相应的电信号。而这样的电信号可以帮助人们判断，通过纳米孔的是哪一个氨基酸。 这一技术称为recognition tunneling，原本是Lindsay等人开发的DNA单分子测序技术。&ldquo 大约两年前，我们的一次实验室会议提出，可以尝试将这一技术用于氨基酸测序，&rdquo Lindsay说。与DNA的A、G、C、T相比，用 recognition tunneling鉴定组成蛋白的二十种氨基酸实际上是一个更大的挑战。 蛋白质单分子测序技术具有巨大的应用价值，可以帮助人们检测被选择性剪切或翻译后修饰改变的微量蛋白。而这些蛋白往往是疾病研究所追寻的目标，用其他技术很难检测得到。 PCR能够将样品中微量的DNA快速扩增，但在蛋白研究领域还没有这样的技术，Lindsay强调。在这种情况下，能进行单分子水平上进行检测的recognition tunneling，&ldquo 将给蛋白质组学研究带来一场彻底的变革&rdquo 。 这项研究为人们展示了一个，快速测序单个蛋白分子的低成本方法。据Lindsay介绍，该技术通过大约50种不同的信号特征来鉴定氨基酸，不过绝大多数鉴别只需要不到10个信号特征。 值得注意的是，recognition tunneling不仅能够高度可信的鉴定氨基酸，区分翻译后修饰的蛋白（肌氨酸）及其前体（甘氨酸），还能够鉴别被称为对映体的镜像分子，以及质量相同但序列不同的分子。 千元蛋白组？ Lindsay的研究指出，可实现千元基因组测序的工具，也可以最终帮助人们完成千元蛋白质组测序。事实上，Lindsay认为这一里程碑离我们并不遥远。 目前，这一技术还需要使用复杂的实验室仪器&mdash &mdash 扫描隧道显微镜STM。不过Lindsay和他的同事正在开发一个可以快速鉴定氨基酸和其他分析物的新设备，以便将低成本的蛋白质组测序真正推广到临床。 该技术不仅可以用来在临床上测序蛋白质和检测新生物指标，还有望给医疗领域带来彻底的改变，在单分子水平上精确监控患者对治疗的应答情况。