新型基因芯片

首张基因诊断芯片投产 将进780家三甲医院 　　长沙生产的生物芯片将帮助医生为患者开出“个性化”处方 　　一季度全省生物医药行业同比增长40%，长沙国家生物产业基地占一半 　　本报讯(记者 林俊) 记者昨日从长沙国家生物产业基地获悉，全球首张个体化基因诊断芯片日前在该基地的安信公司进入产业化阶段，在21世纪“生物芯片”的年代，医生将据此开出更精细的“个性化”药方。该项目由中南大学周宏灏院士领衔研发，并已列入我省新型工业化科技重点项目支持。今年预计可实现产值5500万元。 　　检测结果让患者终身受用 　　个体化基因诊断芯片是生物芯片的一种。记者看到，其外形也像电子芯片一样，是块小薄片，但上面排列的不是集成电路，而是基因序列。“它将引领一个新的用药时代，”参与开发的中试中心主任肖鹏介绍，目前医生为同一类病症的患者开出的药方基本上是“千人一量，万人一配方”，其实人的个体差异直接影响用药效果，用药的多少也应有区别。利用这种芯片，可以准确地检测出患者之间的个体差异，使医生诊断和用药准确，且检测结果能够让患者终身受用。 　　目前，利用个体化基因诊断芯片的成果，中南大学湘雅附属第三医院已建立了我国首家根据基因型用药的“湖南省个体化药物治疗咨询中心”，在我国率先启动了基因导向个体化药物治疗，并取得了卓越的临床效果。 　　基因芯片将进780家三甲医院 　　安信公司董事长黄庆玺向记者透露，未来几年将逐步铺开对基因芯片的普及运用，首先将以院士工作站的模式在全国各省会城市建立检测中心，然后进入全国780家三甲医院。在诊断基因芯片广泛应用的同时公司还将加快研发进度，加大投入，每年增报5到10个病种的基因芯片。 　　根据规划，至2010年，将实现40万人份的芯片产能及60万人份的检验中心检测能力，预计实现年产值可达3.2亿元 到2013年，可实现100万人份的芯片产能及360万人份的检验中心检测能力，预计实现年产值14.7亿元。 　　据省经委统计，今年一季度，全省生物医药行业保持较快增长，实现GDP58.8亿元，同比增长40%，增幅高于省内其他行业。而作为全省惟一的医药开发区，长沙国家生物产业基地一季度累计实现医药产值27.28亿元，占全省医药工业近50%，同比增长35%。据悉，目前园区已有泰尔、丰日等10余家企业筹备上市，且已有相当一部分完成了上市前的准备工作。

注：最新的测序技术会实现全自动化、实时化、微型化，虽然与传统的芯片技术并不相同，但其理念有共通之处，所以也将其纳入&ldquo 芯片&rdquo 范畴。&mdash &mdash 彭雷 　　80年代中期，俄罗斯科学院恩格尔哈得分子生物学研究所和美国阿贡国家实验室(ANL)的科学家们最早在文献中提出了用杂交法测定核酸序列(SBH)新技术的想法。当时用的是多聚寡核酸探针。几乎与此同时英国牛津大学生化系的Sourthern等也取得了在载体固定寡核苷酸及杂交法测序的国际专利。 　　基因芯片利用微电子、微机械、生物化学、分子生物学、新型材料、计算机和统计学等多学科的先进技术,实现了在生命科学研究中样品处理、检测和分析过程的连续化、集成化和微型化。 　　1997年世界上第一张全基因组芯片&mdash &mdash 含有6166个基因的酵母全基因组芯片在斯坦福大学Brown实验室完成，从而使基因芯片技术在世界上迅速得到应用。 　　基因芯片技术主要包括四个基本要点：芯片方阵的构建、样品的制备、核酸分子反应和信号的检测。1、芯片制备，先将玻璃片或硅片进行表面处理，然后使核酸片段按顺序排列在芯片上。2、样品制备，可将样品进行生物处理，获取其中的DNA、RNA，并且加以标记，以提高检测的灵敏度。3、生物分子反应，芯片上的生物分子之间的反应是芯片检测的关键一步。通过选择合适的反应条件使样品中的核酸分子与芯片上的核酸分子反应处于最佳状况中，减少错配比率。4、芯片信号检测，常用的芯片信号检测方法是将芯片置入芯片扫描仪中，通过扫描以获得有关生物信息。 　　基因芯片技术发展的最终目标是将从样品制备、杂交反应到信号检测的整个分析过程集成化以获得微型全分析系统(micro total analytical system)或称缩微芯片实验室(laboratory on a chip)。使用缩微芯片实验室，就可以在一个封闭的系统内以很短的时间完成从原始样品到获取所需分析结果的全套操作。 　　近年,基因芯片技术在疾病易感基因发现、疾病分子水平诊断、基因功能确认、多靶位同步超高通量药物筛选以及病原体检测等医学与生物学领域得到广泛应用。 　　一、第一代基因芯片 　　第一代基因芯片基片可用材料有玻片、硅片、瓷片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜和尼龙膜,其中以玻片最为常用。为保证探针稳定固定于载体表面,需要对载体表面进行多聚赖氨酸修饰、醛基修饰、氨基修饰、巯基修饰、琼脂糖包被或丙烯酰胺硅烷化,使载体形成具有生物特异性的亲和表面。最后将制备好的探针固定到活化基片上,目前有两种方法:原位合成和合成后微点样。根据芯片所使用的标记物不同,相应信号检测方法有放射性核素法、生物素法和荧光染料法,在以玻片为载体的芯片上目前普遍采用荧光法。 　　相应荧光检测装置有激光共聚焦显微镜、电荷偶合器( charge coup led devices, CCD)、激光扫描荧光显微镜和激光共聚焦扫描仪等。其中的激光共聚焦扫描仪已发展为基因芯片的配套检测系统。经过芯片扫描提取杂交信号之后,在数据分析之前,首先要扣除背景信号,进行数据检查、标化和校正,消除不同实验系统的误差。 　　对于简单的检测或科学实验,因所需分析基因数量少,故直接观察即可得出结论。若涉及大量基因尤其是进行表达谱分析时,就需要借助专门的分析软件,运用统计学和生物信息学知识进行深入、系统的分析,如主成分分析、分层聚类分析、判别分析和调控网络分析等。 　　芯片数据分析结束并不表示芯片实验的完成,由于基因芯片获取的信息量大,要对呈数量级增长的实验数据进行有效管理,需要建立起通行的数据储存和交流平台,将各实验室获得的实验结果集中起来形成共享的基因芯片数据库,以便于数据的交流及结果的评估。 　　典型如SuperArray公司的功能分类基因芯片： 　　1、引物设计 　　SYBR Green可与所有的双链DNA反应(包括引物二聚体)，为了使扩增反应集中于目的基因，避免非特异性扩增，引物设计成为关键因素。为得到单一特异的扩增产物，避免扩增出序列相似的非特异性产物，采用BLAST或者其他比对方法，检测引物在相应物种(如人，小鼠或大鼠)全基因组中的特异性。为了保证在相同的PCR条件下(特别是统一的退火温度)，不同基因均能扩增出相应的特异性产物，对引物的CG值，解链温度(Tm)，以及其他化学和物理的特性都进行了优化调整。为了获得高扩增效率，对扩增片段的长度也进行了优化，一般为100到200bp，确保在统一的循环反应的时间范围内，不同基因均能扩增出完整片段。 　　2、反应体系 　　为避免非特异性扩增，使用化学修饰的热启动Taq酶，只有经过热激步骤，Taq酶才能发挥扩增活性。同时，反应体系经过优化，可最大限度减少引物二聚体形成，并且保证较难扩增的片段都得到极高的扩增效率。 　　3、定量结果可靠 　　在标准的96孔PCR反应仪中进行实时定量PCR实验，为了获得高通量，无法为每个样品单独制备标准曲线。在完全相同的PCR反应条件下，希望表达量不同的多个基因均获得可靠的结果，需要确保每个基因都有较高的扩增效率，从而可采用简单的△△Ct方法计算基因表达量。 　　其灵敏度高，样品的使用量低，每张芯片使用的总RNA最少可为0.5ng 可观察到的动态线性范围超过105，可以同时检测表达量差异较大的基因 Ct值的平均差异只有0.25个循环，可检测超过两倍的基因表达量变化。因此，第二代功能分类基因芯片是研究特定信号通路或者一组功能相关基因表达量的理想方法。 　　二、第二代基因芯片 　　尽管基因芯片技术已经取得了长足的发展，但仍然存在着许多难题和不足。目标分子的标记是重要的限速步骤，如何绕过这一步是人们一直期望解决的问题。其次是检测灵敏度不高，重复性差，无法检测单碱基错配的基因样品。再者，待检测的基因样品必须经过PCR扩增技术的处理以获得足够量的待检测样品，使检测过程相对复杂。我们称具备以上特征的基因芯片技术为第一代基因芯片技术，这些特征充分说明基因芯片技术本身存在着较大的发展空间。 　　第二代基因芯片包括如下几种： 　　1. 电极阵列型基因芯片：将微电极在衬底上排成阵列，通过对氧化还原指示剂的电流信号的检测实现基因序列的识别 　　2. 非标记荧光指示基因芯片：利用荧光分子作为杂交指示剂，在不需对靶基因进行荧光标记的前提下，通过对荧光分子的检测实现基因序列的识别 　　3. 量子点指示基因芯片：利用量子点作为杂交指示剂，在不需对靶基因进行荧光标记的前提下，通过对量子点的扫描实现基因序列的识别 　　4. 分子灯塔型基因芯片：利用探针DNA片断的发夹结构，获得单碱基突变检测的能力。 　　三、第三代基因芯片 　　目前，众多的第三代基因芯片现在也推向了市场。第三代基因芯片代表了测序的最高水平和未来走向。 　　1、Illumina微珠基因芯片技术 　　这是Illumina公司核心技术之一，博奥生物基于Illumina微珠芯片平台，推出SNP分型检测服务以及定制SNP分型检测服务。 　　它首先用微机电技术在光纤末端或硅片基质上蚀刻出微孔(深度约为3毫米的相同凹槽)，将&ldquo 微珠池&ldquo 内的微珠&ldquo 倒&rdquo 入光纤束微孔，每个微孔恰可容纳一个微珠，在范德华力和与微孔壁间流体静力学相互作用下，微珠以&ldquo 无序自组装&rdquo 的方式在微孔内组装成芯片。每种类型的微珠平均有 30 倍左右的重复。 　　每一个微珠上都偶联有80万左右拷贝数的探针。每一个探针由特异的地址序列(对每种微珠进行解码，29mer)和特异序列(代表不同的检测信息，如SNP 位点序列、基因序列等)组成。用专利的解码技术对芯片上的微珠进行解码，完成对芯片微珠定位信息的收集和确认，也实现芯片生产过程中100%质控。 　　以四种荧光标记进行16种微珠解码为例，解码过程使用与地址序列互补的且分别标记4种荧光染料的探针进行。把标记4种荧光的不同地址序列探针进行组合，每次杂交后探针清洗下来进行下一轮杂交，通过多轮杂交达到指数型区分能力。 　　2、Ion Torrent半导体基因芯片 　　Ion Torrent半导体基因芯片是最新一代的测序技术，它的问世给测序技术的应用带来了激动人心的进展。它采用了半导体技术和简单的化学试剂进行DNA测序，而不是使用光作为媒介。在半导体芯片的微孔中固定DNA链，随后依次掺入ATCG。随着每个碱基的掺入，释放出氢离子，在它们穿过每个孔底部时能被检测到，通过对H+的检测，实时判读碱基。 　　Ion Torrent个人化操作基因组测序仪(PGMTM)是第一台基于半导体技术的测序仪。与其他测序技术相比，使用该项技术的测序系统更简单、更快速、及更易升级。该测序仪与其他高通量测序仪特征互补，可以迅速完成应急服务项目，缩短服务周期，增加服务效率。 　　3、实时单分子测序基因芯片 　　太平洋生物科学公司(PacBio)实时单分子测序基因芯片是直接测由DNA聚合酶将荧光标记的核苷酸掺入互补测序模板。该技术的核心是一个零点启动模式的波导(Zero-mode Wavelength，ZMW)纳米结构的密集排列， 这一排列阵可以进行单个荧光分子的光学审视。 　　在过去，零点启动模式波导结构被用于从大量高密度的分子中分辨出单一的荧光分子，还没有被用于大量平行分析的操作。为使之用于大量平行分析和数据输出通量(测序数据生成能力)，太平洋生物科学公司开发出一种方法，能有效地将零点启动模式波导结构排到表面上，他们采用了电子束光刻技术(Electron beam Lithography)和紫外光电子束光刻技术(Ultraviolet Photo lithography) 以及高度平行的共焦成像系统， 这样可以对零点启动模式纳米结构中的荧光标记分子进行高灵敏度和高分辨率的探测，并采用了一个沉重的稳定平台来确保良好的光学聚焦效果。 　　4、纳米球基因芯片 　　全基因组学公司(Complete Genomics)的纳米球基因芯片是以杂交和连接反应为核心的。当通过杂交和连接进行测序的方法出现以后，全基因组学公司推出了新的样品处理方法和纳米阵列平台。基因组DNA首先经过超声处理，再加上一些接头，然后模板环化，酶切。最后产生大约400个碱基的环化的测序片段，每个片段内含有4个明确的接头位点。环化片段用&Phi 29聚合酶扩增2个数量级。一个环化片段所产生的扩增产物称为DNA纳米球(DAN nanoball, DNB)。纳米球被选择性地连接到六甲基二硅氮烷处理的硅芯片上。 　　5、纳米孔基因芯片技术 　　另外，还在发展中的纳米孔基因芯片技术是很有潜力的第四代技术。因为这种方法不再需要光学检测和同步的试剂洗脱过程了。 　　这是一种基于纳米孔(纳米洞)结构的完全不同的测序技术，单个碱基的读取可以靠测定经由纳米级别的孔洞而跨越或透过薄膜的电导率来进行。纳米孔技术可以广泛地归纳为两类：生物类和固态类。 　　&alpha 溶血素是一种能天然性地连接到细胞膜中继而导致细胞溶解的蛋白质，它第一个被用来做成生物纳米孔模型。第二类纳米孔是以硅及其衍生物进行机械制造而成。 使用这些合成的纳米孔可以降低在膜稳定性和蛋白定位等方面的麻烦，而这些正是牛津纳米孔公司所创立的生物纳米孔系统一直遇到的问题。 　　例如，Nabsys就发明了一套系统，他们以汇聚的离子束将硅片薄膜打成纳米孔，用于检测与特异性引物进行了杂交的单链DNA穿过纳米孔时的阻断电流变化。 IBM创建了一个更为复杂的系统，能有效地使DNA位移暂停，并在暂停的时候通过隧道电流检测识别每个碱基。 　　四、基因芯片市场分析 　　1、国外市场美国illumina公司一家独大 　　在SNP芯片研究领域，美国illumina公司毫无疑问是霸主，illumina公司凭借自己开发的GoldenGate技术和infinium专利技术一直在SNP芯片领域处于垄断地位。 　　illumina的全基因组表达谱芯片是目前唯一一种可以达到探针30倍重复的表达谱芯片，其他的芯片都只能达到1-8倍技术重复。因此illumina的全基因组表达谱芯片的重复性是所有芯片中最高的，其重复性R20.996，并且基于第三代基因芯片独特的微珠芯片生产工艺，芯片生产成本较低，信噪比和灵敏度都非常高，其灵敏度&le 1:250,000，芯片检测结果和qPCR相关系数R2=0.97。 　　因为illumina所占的市场份额越来越多，2012年6月另一基因芯片大厂家Nimblegen公司，正式宣布退出基因芯片市场。 　　2、国内市场刚刚起步 　　国内基因芯片制造水平低，相关的企业规模小、投入也少，远达不到国外的水平。所以国内的相关公司均以引进国外基因芯片，提供检测服务为主。不过，随着基因芯片的应用推广，一些公司也开始涉足基因芯片制造。 　　上市公司达安基因，业务以体外诊断为主，产品主要是试剂盒，但也开始涉足基因芯片制造。达安基因2013年申报的三个专利：一种用于基因检测的电路板 ZL201320244125.X 一种电化学基因芯片 ZL201320244116.0 一种基于基因芯片的检测装置 ZL201320244734.5。 　　而另一以基因检测服务著称的大企业华大基因，则通过收购国外公司进入基因芯片制造领域。美国上市公司Complete Genomics 公司有自己基因芯片和芯片检测设备。但该公司2011年的业绩只有2000多万美元，其基因测序服务成长大大低于预期，股票跌破发行价，最后被中国华大基因收购。 　　联川生物在microRNA芯片领域也小有名气，也是唯一一家国产的microRNA芯片，该芯片最大的特点就是更新速度极快，一般新的数据库发表后，第一个将芯片更新到最新版本的就是联川生物。illumina公司于2010年退出了microRNA芯片市场，因illumina公司2006年收购了高通量测序领域NO.1的Solexa公司，成为唯一一家即拥有芯片平台又拥有高通量测序平台的供应商，illumina认为在microRNA领域，高通量测序有不可比拟的技术优势，必然会取代芯片，所以于2010年停产了microRNA芯片。

俞菁(化名)是一名手语翻译，她的妈妈因为小时候一次注射庆大霉素致聋，但她自己的听力得以保持健全。俞菁有一位好姐妹，情况却正好相反，她妈妈听力正常，而她自己在小时候在一次药物注射后变成了听障患者。 　　去年，她们都参加了北京市的一个高危人群致聋基因筛查，结果两个人都是致聋基因的携带者，只是因为俞菁从小有意识去避免注射一种药物，而她的好姐妹却毫无知情用了这种药，导致了两个人走向了完全不同的人生。 　　博奥生物市场总监赵智贤告诉记者，“俞菁的妈妈和她的聋人姐妹刚出生时没有出现耳聋，都是在后天被注射了链霉素、庆大霉素等氨基糖甙类药物致聋。”我国每年因迟发性耳聋及药物性耳聋的新增患者可达3万多人，其中60%的是由于致聋基因造成。 　　事实上，很多医生都知道该类药物会导致基因突变引起的药毒性耳聋，但以往依靠传统基因测序方式需要3天，且耗资昂贵。作为此次北京市致聋基因筛查的承担者，博奥生物采用了一种新的耳聋基因芯片检测技术，“该芯片上涵盖了导致中国人群耳聋最常见的4种基因的9个突变位点，做一次检测只需要5小时，价格几百元。”赵智贤说。 　　基因在我们身体里已经“神秘地行动”很久了，而不管你了解或不了解，信或不信，它都会导致完全不同的结果甚至人生。人类迫切地希望解码自己的基因，在种种关于未来10大技术趋势的预测中，好几项也都跟基因技术相关。 　　耳聋芯片是目前基因芯片的一种最普通的应用。所谓的基因检测芯片，其外形与电子芯片一样，但上面排列的不是集成电路，而是基因序列。它把大量已知基因序列的核酸片段识别探针，集成在一块指甲大小的玻璃片或硅片表面，通过与样品进行反应，基因会呈现出不同的表达信号，用计算机技术收集信号数据，分析样品的基因突变情况来诊断遗传性疾病。虽说基因芯片早在20世纪末就成功问世，并应用于药物筛选和实验室研究，但普通人对它还是知之甚少。 　　“有成千上万个鱼钩的钓杆” 　　如果说以前的基因检测技术均只有一个“鱼钩”，一次只能钓到一条鱼(一种基因)。那么，基因芯片就好比是一根有成千上万个鱼钩的钓杆，可同时捕捉许多不同的鱼，从而实现对千万个基因的同步检测和鉴定。它具有高效率、高通量、快速简便等特点。赵智贤说，耳聋芯片可以提供从孕前、产前到出生的基因检测，“只需要从母亲的羊水中提取一滴样品，或者一滴血就可以完成整个检测。”它可帮助生育父母及时获知新生命的遗传信息并采取措施，降低新生儿患遗传性疾病。 　　基因芯片将改变“万人一配方”的用药模式，在个性化配方上，未来西医与中医有可能殊途同归。目前医生为同一类病症的患者开出的基本都是标准化药方，其实人的个体差异直接影响用药效果，用药的多少也应有区别。 　　人类基因组编码大约有10万个不同的基因，一个基因又有成千上万个位点，“多数慢性病会跟几十个基因中几个或更多突变位点相关。基因芯片可以对基因分类，并尽可能找出相关的位点，发现哪些基因和位点对于预后表达得好，哪些表达得不好，再根据比对结果提供个性化治疗”。一位从事基因检测芯片服务的海归创业者解释道。 　　“结核病最难治的地方，是其耐药性高。原来查基因耐药需要4～8周的时间，而期间多数治疗都是经验用药，如果产生耐药，不但治不了病，反而会加重病情，延误治疗。结核病检测芯片将检测时间缩短至6个小时，为治疗赢取时机。”赵智贤以具体案例作了实证。 　　基因芯片给西医带来的最大改变，是它可以检测出患者之间的个体差异，使医生诊断和用药更及时和提高准确性，但这需要建立在大量的科研基础之上，而且基因的筛查要经过时间的推移才能显现出效果来。 　　尽管当前基因芯片技术尚未完全成熟，但是却挡不住它的商业脚步。在国内一些医院或体检机构，现在可以看到这样的广告：只需一滴血或一份唾液样品，你就可以预知会否患上癌症，将健康掌握在自己手中。在美国，越来越多的零售商开始通过互联网直接面向消费者提供基因诊断测试，他们的口号是不借助医生就可以从基因水平上了解自己的健康状况。这种测试甚至已开始通过互联网瞄准国际市场。 　　通常，消费者只要付款就能得到一份包括自身的基因、特质及潜在病症的风险等级清单，另外还包括一份针对个人的用药建议以及生活、饮食和环境上的综合健康建议，如节食和运动等。国内的价格在2～3万元不等。 　　基因芯片的“管”与“放” 　　那么，这种基因诊断到底有多靠谱?博奥生物从技术角度给出了一套标准。基因芯片技术必须建立在大量已知基因和基因改变与疾病关系的基础上，因此其所检测的疾病相关基因数应该越多越好，而且需要建立一个异常庞大的基因与疾病关联数据库，同时要有一套科学的数学模型。还有，基因检测具有一定的种族针对性，“也就是说如果比对的人群数据库不同，检测的结果也会有差异。” 赵智贤说。 　　而由4位美国生物伦理学、法律及医学方面的专家组成的研究小组对于该种基因测试是否适用于市场进行了研究。他们表示，基因测试都要通过同一类型的集中数据市场前期调查，许多基因测试公司都给出了长期的预测结果，实际上，要完全了解这些风险与益处需要几十年的时间。 　　基因芯片三大难题 　　“基因改变与疾病的关系并不能一一对应，所有基因检测的结果，并非一定就会发生。同样，即使你检测出来携带耳聋基因，也并不意味一定会出现药毒性耳聋。基因芯片还不能完全取代目前临床实验室诊断，”海归的基因检测创业者认为，当前这个阶段应该客观地看待基因芯片技术，但是，“谁也不能否认它的医学参考价值”。 　　基因芯片的商机不可预估，谁都想抢一把风气之先，“管它是不是萝卜先占个坑”，这使得不管是国际还是国内市场都处在一种鱼龙混杂的阶段。目前我国生物芯片企业不少于50家，但获得国家有关部门认证的只有极少数。某些机构把基因检测的销售业务外包出去之后，出现了一些销售方式上的“变味”，有的甚至变成了传销。另外，美国的研究小组也在《科学》杂志发文表示，美国市场上90%的基因测试都没有通过正式的管理评估。 　　企业在冒进，而真正的市场化却还远没开始。造成这种现象的原因很复杂，赵智贤认为，目前基因芯片在药监局的审批难，进入物价收费流程难以及进入医保体系难这三大难题，使得其真正迈入市场化商业之路还很远，而在此之前出现一些市场“乱象”并不难理解。 　　目前的基因芯片价格还是相对昂贵，而且操作复杂、费时，对操作人员的专业素质要求比较高，国内缺乏大量相应的专业基因检测和数据分析人员，这也是推进市场化前要越过的障碍之一。2011年卫生部下发通知，决定将基因芯片诊断技术审批权“下放”到省级卫生主管部门。这意味着今后在临床上，将有越来越多的有资质的临床医生使用该项技术。 　　如何让基因测试尽早接触市场，加速其产业化，是各国政府共同的心态。海归的基因检测创业者如此分析国内外形势。在这种心态下，是先“管”起来，还是先“放”下去，“一管一放”的力度又该如何把握，并导致不同的行业生态，这对于各国政府都不是一件轻松的事情。