真菌霉素

问题: 请教一下各位，像黄曲霉素这类真菌毒素的标液要按照危险化学品进行管理么？回复: 生物安全有要求的

[align=center][b]食品中真菌毒素的测定方法小结[/b][/align][align=center][b] [/b][/align] 真菌霉素是指真菌在生长繁殖过程中产生的次生有毒代谢产物，食用了含有真菌霉素的食物会导致中毒。食用油中的真菌霉素主要来源于油料作物生长过程中感染病原真菌，还有就是油脂在加工、储存、运输过程中感染真菌霉素。食用油中常见的真菌霉素为黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A、呕吐毒素以及玉米赤霉烯酮等。常见的检测方法包括薄层色谱法、液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、酶联免疫法等。液相色谱法灵敏度较高、检测限低，是目前国内测定真菌毒素使用最多的方法。基于HPLC的方法大多采用免疫亲和柱的前处理方法，检测成本较高。也有采用SPE的预处理方法，重现性不高。[b]瓶颈和方向[/b]目前国际、国内的主流趋势是多毒素同时测定的技术，采用的设备为HP[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS，GB5009.22-2016 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定（第一法 同位素稀释液相色谱-串联质谱法），GB5009.96-2016 食品中赭曲霉毒素A的测定（第三法 免疫亲和层析净化液相色谱-串联质谱法），GB 5009.111-2016 食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定（第一法 同位素稀释液相德普-串联质谱法），GB 5009.209-2016 食品中玉米赤霉烯酮的测定（第三法 液相色谱-质谱法），但是需要使用碳同位素内标，价格比较昂贵（Sigma 25mg/L, 1mL约1.2万人民币）。开发此种方法前期的投入比较大，但可以节约时间，预处理的时间至少可以节约50%，减少前处理过程中昂贵的免疫亲和柱的使用。[align=left]建立多毒素同时测定的方法（[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS）。同时扩展检测项目（包含T-2, HT-2, Citrinin, Fumonisin, Ergot alkaloids 、sterigmatocystin、beauvericin、AOH、AME和TeA、enniatins等），另外增加Citrinin, Ergot alkaloids 、sterigmatocystin、beauvericin、AOH、AME和TeA、enniatins主要存在谷物及谷物制品中毒素的检测能力，降低毒素潜在的致畸、致癌风险。[/align][align=left][b][/b][/align][align=left][b]毒素中快检技术的应用[/b][/align] 国内市场真菌毒素快检产品主要是基于抗原、抗体（不排除使用受体和配体）特异性反应的免疫快检产品。主要包括胶体金检测卡、酶联免疫检测试剂盒和时间分辨荧光免疫检测卡等，相关的快检仪器设备有酶标仪、胶体金读卡仪和时间分辨荧光检测仪荧光共振能量仪、噬菌体PCR仪、新型电化学传感器等。此外，还包括一些前处理方法和设备，如净化柱、在线免疫亲和柱等。

真菌毒素无处不在 真菌毒素的检测方法1 生物鉴定法生物鉴定法利用真菌毒素能够影响微生物、家禽、水生生物等的细胞代谢过程来鉴定真菌毒素的存在，根据对生物体产生的病变、异常或死亡等判定真菌毒素的危害，该方法对样品的纯度要求较低，该方法主要用于定性分析，专一性较差，灵敏度较低，一般只是作为其他分析方法的佐证。2 化学分析方法化学分析方法检测真菌毒素主要包括以下步骤：提取、脱脂、净化、分离和鉴定。早期常用的化学分析方法有薄层层析法（Thin Layer Chromatography, TLC）和柱层层析法（ColumnChromatography,CC）。在20世纪80年代，我国将TLC作为食品及饲料中黄曲霉毒素的标准测定方法（GB/T8381-1987），将样品经提取、净化和浓缩处理后，在薄层层析板上分离后，利用黄曲霉毒素在紫外照射下可发荧光的特性进行检测。张华报道的薄层层析法检测检测霉菌毒素的灵敏度为5μg/kg，方法的结果准确，重现性好，回收率为 85%-100%。用薄层层析方法己分离出黄曲霉毒素、杂色曲霉素、青霉酸和构巢曲霉素等。柱层层析在真菌毒素样品前处理过程中得到了广泛的应用，柱层层折常用的吸附剂有氧化铝、活性炭、硅胶、镁等，将吸附剂填充到管中形成固定相，将样品提取液上柱，用流动相洗脱，利用样品中不同物质在固定相和流动相中分配系数的不同，实现样品中不同物质的分离，进而进行检测。利用亲和力不同的溶剂和不同固定相的组合可以形成不同分离能力的层析柱。基于吸附剂进行前处理的柱层析分离技术对靶标物的选择性不强，近年来，基于免疫亲和层析技术的样品前处理在真菌毒素提取中应用逐渐广泛。免疫亲和柱是将真菌毒素特异性抗体通过一定方式偶联固定在载体基质上，装柱形成微柱，用于样品前处理。其工作原理是样品溶液中的真菌毒素在流经亲和柱时，载体基质上的抗体特异性的捕获样品溶液中的真菌毒素，使真菌毒素得到净化和富集，待上样完成后用高浓度的甲醇、乙腈等溶液洗脱，将真菌毒素释放出来，得到的洗脱液用于检测。3 仪器分析法仪器分析方法是对样品进行一定的提取、净化处理后，借助检测仪器设备对待测靶标物进定性、定量分析的技术。在真菌毒素的检测分析中，常用的方法有高效液相色谱法（HighPerformance Liquid Chromatography, HPLC）、超高效液相色谱法（Ultra HPLC，UHPLC）、高效液相色谱法与质谱联用方法（HPLC-tandem mass Spectrometry， HPLC-MS/MS）、气相色谱与质谱联用法、高效液相毛细管电泳方法等。HPLC 方法是 20 世纪 60 年代末在气相色谱基础上发展起来的一种以液体为流动相的新型谱技术，在真菌毒素的检测中常采用反向色谱法。近年来，在 HPLC 方法的基础上发展起来的UHPLC 和 HPLC-MS/MS 方法比 HPLC 方法具有更高的检测灵敏度和检测通量。基于HPLC 的方法广泛的被国内外实验室和检测机构作为真菌毒素确证性检测方法。我国食品安全国家标准 GB541337-2010 中规定免疫亲和层析净化液相色谱-串联质谱法和免疫亲和层析净化高效液相色谱法分别作为乳和乳制品中 AFM1测定方法。HPLC 方法具有灵敏度高、测定结果准确可靠、特异性好的特点，基于免疫亲和柱前处理的HPLC方法与化学分析方法和生物鉴定法相比，检测时间缩短，对复杂样品的处理能力更强。但是仪器分析方法也有其缺陷，需要使用大量的有机溶剂，依赖大型精密仪器，检测成本高，需要专业的操作人员，不能满足现场快速筛查的需求。4 免疫分析方法免疫分析方法起始于20世纪50 年代，继 60 年代竞争分析原理提出后取得了巨大的进步，成为生物分析的重要手段之一。免疫分析方法从本质上说属于一种特殊形式的试剂分析法，将抗体作为核心分析试剂，基于抗体与抗原的特异性结合反应，对待测靶标物，包括小分子化合物、大分子的酶、蛋白质等，进行定性和定量分析。抗体和抗原反应的典型特点是抗体能特异性识别抗原，并发生结合反应，这种反应是可逆的，抗体与抗原的专一性比一般分析试剂间专一性强。免疫分析技术已广泛的应用于临床分析检测、食品安全检测、环境污染检测领域。免疫分析技术最早出现的是放射免疫分析，由 Berson和 Yallow首次使用，该方法的灵敏度高、特异性好，但是其最大的缺点是分析过程引入放射性核素，对操作人员和环境造成危害和污染。4.1 酶联免疫吸附法酶联免疫吸附分析法（Enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA）是在免疫酶技术基础上发展起来的免疫分析方法，于 1972 年由 Engvall 首次用碱性磷酸酯酶标记免疫球蛋白用于 IgG 的测定。现已广泛的应用于分析检测领域，检测对象包括疾病诊断中的大分子检测，食品安全检测中的小分子污染物检测。ELISA 方法的原理是将抗原或抗体与酶标记后形成酶标抗原或酶标抗体，既保持抗原、抗体的免疫活性，又具有酶活性，将待测物与酶标记抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面的抗体或抗原反应，洗涤去除未反应结合的物质，最后根据固相载体上酶的量与待测靶标物的对应比例关系进行定量分析。该方法根据反应模式的不同可分为夹心 ELISA 方法和竞争ELISA 方法，夹心 ELISA 方法主要用于检测大分子化合物，竞争 ELISA 方法主要用于检测小分子化合物。真菌毒素属于小分子物质，由于只有一个抗体结合位点，因此在真菌毒素的ELISA检测中常采用竞争分析模式。Wang等人建立了基于多克隆抗体检测AFM1的ELISA快速分析方法，对AFM1和 AFB1的检测灵敏度（IC50值）为分别为 0.014 和 0.02 ng/mL。Zhang等人研制了针对 OTA 的单克隆抗体，并用该抗体建立了间接竞争ELISA 方法测定谷物中的 OTA，方法的检出限为 0.15 ng/mL，灵敏度为 1.7ng/mL，检测范围为 0.55-6.75 ng/mL。Burmistrova 等人建立的基于单克隆抗体的 ELISA 方法在 ZEA 的检测中，检出限为 0.1 ng/mL，灵敏度为。4.2 免疫亲和方法免疫亲和方法主要用于样品的前处理过程中，主要利用抗体对待测物的专一识别特性，对待测物进行净化和浓缩，能够有效的去除样品基质干扰，提高检测灵敏度和准确性。基于免疫亲和柱的色谱分离方法被我国国家标准和国际标准定为真菌毒素检测的标准方法。免疫亲和柱常与其他检测方法联用，Li 等建立了基于免疫亲和柱的 ELISA 方法检测农产品复杂基质中的 OTA，结果表明在 OTA 添加样品检测中，经过免疫亲和柱处理后的 ELISA 检测回收率明显较未经亲和柱处理的方法回收率高。免疫亲和柱不仅可以用于样品前处理，还可直接在亲和柱上进一步反应进行定性或定量分析。Yu 等人基于免疫竞争反应原理建立了在免疫亲和柱上进行可视化检测 AFM1的方法，在样品上样完成后，再从亲和柱底端加入辣根过氧化酶（HRP）标记的 AFM1，洗脱后加入酶底物，进行显色，显色深浅与样品中 AFM1浓度成反比，根据显色深浅判别 AFM1的含量，该方法对 AFM1的灵敏度为 40 ng/L。Yuan等人基于免疫竞争原理，在凝胶上固定抗体后，制成免疫亲和柱，使其竞争性结合氯霉素和 HRP 标记的氯霉素，加入底物后显色，最终实现了对氯霉素的快速检测，方法的检出限为 1 ng/mL。4.3 [color=#0751