小鼠内脏组织

本文由中国药科大学天然药物国家重点实验室药物代谢与药代动力学重点实验室所作，发表于Talanta 165 (2017) 128–135。 近年来，基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱成像（MALDI-TOF-MSI）技术受到了广泛的关注，因为它可以对动植物组织切片中不同的分子进行定位，尽管在逐点绝对定量中仍存在一些障碍。奥曲肽是一种合成的生长抑素类似物，在临床上广泛应用于预防胃肠道出血。 本研究的目的是建立一种定量显示奥曲肽在小鼠组织中空间分布的MALDI-TOF-MSI方法。在这个过程中，一个结构相似的内标物与基质溶液一起被点到组织切片上，以尽量减少信号变化，并给出良好的定量结果。通过比较奥曲肽与不同基质共结晶后MALDI-TOF-MSI产生的信噪比，选择2,5-二羟基苯甲酸作为最合适的基质。通过测定不同浓度的新鲜组织切片中奥曲肽的含量，验证了MALDI-TOF-MSI在线性、灵敏度和精密度方面的可靠性。验证的方法成功地应用于奥曲肽在小鼠组织中的分布研究。 结果表明，MALDI-TOF-MSI不仅能清晰地显示奥曲肽的空间分布，而且可以计算关键的药代动力学参数（Tmax和t1/2）。更重要的是，MALDI-TOF-MSI测定的奥曲肽的组织浓度-时间曲线与LC-MS/MS测定的结果一致。这些发现说明了MALDI-TOF-MSI在药物开发过程中的药代动力学分析潜力。使用仪器：岛津MALDI TOF、 LC–MS/MS 图1 内标对MALDI-TOF-MSI分析小鼠肝切片中奥曲肽线性的影响。(A) 小鼠肝脏切片上的兰瑞肽(内标)的质谱图，(B)加入奥曲肽标准溶液的肝脏切片光学图像，(C)5个浓度水平的奥曲肽的代表性质谱图像([M+H]+离子 m/z 1019 Da)，(D) 用奥曲肽的平均信号强度绘制的奥曲肽校准曲线(n=5)，(E)经内标校正后的奥曲肽的代表性质谱图像，(F) 用奥曲肽/内标的平均强度比绘制的奥曲肽校准曲线(n=5) 图2 对口服20 mg/kg奥曲肽后0、10、30、60、90和120 min采集的小鼠组织进行成像MS分析。(A)胃切片的代表性光学和质谱图像，(B)肠切片的代表性光学和质谱图像，(C)肝切片的代表性光学和质谱图像 图3 MALDI-TOF-MSI和LC-MS/MS测定奥曲肽的组织浓度-时间曲线。(A) MALDI-TOF-MSI法测定小鼠胃中奥曲肽的浓度-时间曲线 (B) LC-MS /MS法测定小鼠胃中奥曲肽的浓度-时间曲线 (C) LC-MS/MS法和MALDI-TOF-MSI法测定小鼠胃中奥曲肽的含量的相关性分析。 本研究开发了一种基于MALDI-TOF-MSI的小鼠组织切片奥曲肽定量分析方法。首次通过比较DHB、CHCA和SA提取的奥曲肽在一系列激光功率水平下的信噪比，系统研究了激光能量对MALDI基质选择的影响。结果表明，DHB、CHCA和SA的最优功率水平应分别设置为50、70和60，DHB因其较高的灵敏度和较低的基质效应最终被选为最合适的MALDI基质。兰瑞肽是一种与奥曲肽结构相似的生长抑素类似物，被用作内标，通过减小组织异质性、基质晶体异质性和激光功率波动引起的离子信号变化，提高分析的线性、准确性和精密度。然后成功地应用所开发的MALDI-TOF-MSI方法，观察口服20 mg/kg剂量后，奥曲肽在小鼠胃、肠、肝中的分布和消除过程。 结果表明，MALDI-TOF MSI不仅能清晰地显示奥曲肽在小鼠组织中的空间分布，而且使关键药物动力学参数(Tmax和t1/2)的计算成为可能。更重要的是，MALDI-TOF-MSI测定的奥曲肽的组织浓度-时间曲线与LC-MS/MS绝对定量的结果吻合较好。 文献题目《Optimization and evaluation of MALDI TOF mass spectrometric imaging for quantification of orally dosed octreotide in mouse tissues》 使用仪器岛津MALDI TOF、 LC–MS/MS作者Tai Rao, Boyu Shen，Zhangpei Zhu, Yuhao Shao, Dian Kang, Xinuo Li, Xiaoxi Yin, Haofeng Li,Lin Xie, Guangji Wang, Yan Liang Key Lab of Drug Metabolism &hamacokinets,State Key Laboratory of Natural Medicines,China Pharmaceutical University, Tongjiaxiang 24, Nanjing 210009 PR China

小鼠原代海马神经元细胞的分离培养方法！海马体主要负责记忆和学习，日常生活中的短期记忆都储存在海马体中。神经元是构成神经系统结构和功能的基本单位。神经元具有长突起，由细胞体和细胞突起构成。小鼠海马神经元细胞的组织来源于实验小鼠的正常脑组织，因为海马神经元细胞类似于干细胞属于高分度分化的细胞特性，具有不能传代，不能增殖等特点，所有收到细胞后尽快使用。为了更好的服务于广大科研工作者，百欧博伟生物技术人员特提供了海马神经元细胞分离培养方法，技术因人而异仅供参考：1、试验所需仪器设备及试剂（1）仪器生物安全柜CO2细胞培养箱荧光倒置显微镜高速冷冻离心机电热恒温鼓风干燥箱（2）试剂耗材T25细胞培养瓶血球计数板细胞培养孔板红细胞裂解液神经元完全培养基0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）多聚甲醛（PFA）DAPITriton X-100山羊血清NSEGoat anti-Rabbit lgG（H+L）Cross-Adsorbed Secondary antibody，Alexa Fluor 594Fluoromount-G荧光封片剂2、分离培养方法1) 取1-10 d的新生小鼠。用75%的乙醇浸泡，2) 在冰浴的PBS中分离海马，PBS洗涤3次，剪碎，3) 用0.25% Trypsin + 0.1% Ⅰ型胶原酶37℃水浴振荡消化30min，4) 用FBS终止消化，轻轻吹打，5) 过100 μm 滤网，6) 收集滤液，300 g离心5 min，7) 用完全培养基重悬沉淀，铺瓶。3、免疫荧光3.1.实验步骤（1）细胞爬片取3片玻璃片于24孔板中，每孔加入培养基1mL，加入细胞0.02million个/孔。置培养箱2h或过夜。（2）固定细胞爬片后，吸出培养基，用PBS洗1遍，加入4% PFA于4℃固定30min。用PBS洗3×5min/次。也可最后一次不吸出PBS，放4℃过夜。（3）破膜封闭将玻片除去水分，置于培养皿支撑物上，玻璃片封闭液配置：0.5% Trition X-100与PBS 1:1混合，再加10% 血清，取50uL破膜封闭液滴于防水膜上，将玻片上有细胞的一面盖上2h。（4）一抗孵育一抗配制：抗体与PBS 1:100（200）稀释破膜封闭后，取50uL一抗于防水膜上（湿盒中），将玻片（有细胞的一面）盖上置于4℃（最多可放置一周）（5）二抗孵育室温避光孵育二抗（二抗:PBS=1:500）2h后，PBS洗3×5min/次，染DAPI（DAPI:PBS=1:1000）5min，PBS洗3×5min/次。（6）包埋玻片上各滴1滴Fluoromount-G，将有细胞的一面盖上。鉴定细胞为P1代细胞3.2.检测结果（1）细胞免疫荧光鉴定照片阴性100X-DAPINSE100X-DAPI（2）检验基本情况：经免疫荧光鉴定，该细胞纯度达到90%以上。除了上述的细胞分离方法以外，百欧博伟还有很多关于其他细胞的分离方法，想要学习的小伙伴可以来百欧博伟进行现场学习，如果想要其他原代分离培养方法，可打电话或咨询相关技术人员哦。

优势● iMScope QT可测量的最大范围超过100万像素，能够进行大面积样本分析，例如在一次检测中对小鼠大脑全切片进行分析。● iMScope QT的分析速度比前一代产品快8倍以上，能够进行快速分析。● iMScope QT具有高质量准确度、分辨率及高空间分辨率，能够进行精确质谱成像分析。 概述质谱成像技术可以通过质谱仪直接检测生物分子和代谢物，同时保留其在样本组织上的位置信息，因此，可以生成不同生物分子基于特定离子信号强度和位置信息的二维质谱图像。iMScope成像质谱显微镜是用于质谱成像分析的整合型仪器，结合了光学显微镜和质谱仪，能够分析物质的结构和分布特征，拓展了药物研发和代谢物研究等领域的范围。通过将MALDI转换成LC和ESI系统，iMScope还可用于LC-MS定性及定量分析。本文将介绍配备Q-TOF质谱仪的新型iMScope QT（图1），并与前一代iMScope TRIO设备进行比较。图1 iMScope QT 小鼠全脑切片分析前一代iMScope TRIO设备的最大可测量范围是250 × 250像素。在iMScope QT中，可测量范围已扩展至1024 × 1024像素，能够以15 μm的空间分辨率分析小鼠全脑切片（约17mm × 9.4 mm）。根据表1条件进行检测，可在m/z 885.557处获得磷脂酰肌醇PI (38:4)，并在m/z 888.631处获得硫苷脂(C24:1)的清晰质谱图像（图2）。 此外，由于iMScope QT的最大激光频率为20 kHz，分析速度比iMScope TRIO快8倍以上。结果显示完成图2所示的小鼠全脑切片（702624 pix）质谱成像分析仅需6小时。 表1 分析条件图2 小鼠全脑切片的质谱成像结果（空间分辨率：15 μm） 小鼠小脑的高空间分辨率分析对小鼠小脑附近的区域进行高空间分辨率质谱成像分析，如图2（a）中红色部分所示。根据表1中的分析条件，空间分辨率为5 μm。如图所示，可在m/z 885.557处获得 PI (38:4)、在m/z 888.631处获得硫苷脂(C24:1)，检测到更清晰更详细的质谱图像（图3(b)和(d)）。 此外，由于iMScope QT的质量准确度和分辨率较高，能够分离和检测PI (38:4)的同位素（m/z 888.573）和硫苷脂(C24 :1)（m/z 888.631），并能提取每种同位素的质谱图像（图3(c)和3(d)）。而iMScope TRIO则无法获得以上结果。 图3 小鼠小脑的光学图像和质谱图像（空间分辨率：5 μm） (a) 光学图像(b) PI (38:4)的质谱图像，m/z 885.557(c) PI (38:4)同位素的质谱图像，m/z 888.573(d) 硫苷脂(C24:1)的质谱图像，m/z 888.631 结论与iMScope TRIO相比，iMScope QT的分析范围更广，分析速度更快，可实现更广泛的快速成像分析。此外，随着检测准确度和分辨率的提高，能够对各种目标化合物进行高精确度、高特异性的质谱成像分析。 iMScope QT不仅整合了质谱和形态学分析，而且能够在更广泛的领域实现更快速、更灵敏以及更高的空间分辨率的检测。 本文内容非商业广告，仅供专业人士参考。