热释放性能

外泌体和其他细胞外囊泡 (sEVs) 提供了一种特殊的细胞间交流方式。miRNA是高度保守的非编码小分子RNA。有的miRNA滞留细胞内，通过沉默目的mRNA来参与细胞自身重要生理功能的调控，而有的 miRNA能被分泌出去 ，包裹进具有脂质双层膜结构的外泌体里，被其他细胞吸收，从而介导不同细胞和组织间的信号交流和协调【1-3】。一直以来，外泌体/细胞外囊泡及其分泌的miRNA均被作为多种重要疾病的明星分子得到关注，这是因为它们不仅在疾病诊断和检测中具有重要意义，还可被外源性加工以治疗疾病 (图1)。图1. 细胞外miRNA的疾病治疗前景(摘自C. Ronald Kahn院士组2019年在Cell Metabolism的综述) 【1】尽管外泌体和miRNA的研究如火如荼，我们对决定miRNA是被释放到外泌体还是滞留细胞内的分子机制知之甚少，极大地阻碍了我们对miRNA的生物学功能的研究及疾病治疗的应用。2021年12月22日，来自美国哈佛大学医学院C. Ronald Kahn院士组 (美国国家科学院及美国医学科学院) 的研究人员在Nature杂志在线发表了题为MicroRNA sequence codes for small extracellular vesicle release and cellular retention 的研究论文，在此前同一课题组发表的另一篇研究miRNA在组织脏器间介导信号交流的Nature文章【2】的基础上，通过比较分析5种不同组织来源细胞系的细胞培养基，发现了决定miRNA被分泌到外泌体中或滞留胞内的特定序列，揭示了循环外泌体miRNA导向特定组织器官的重要机制。这一发现有助于我们更好地提高RNA治疗的精准性。为研究决定miRNA在细胞滞留 (cellular retention) 或从外泌体分泌的分子机制，研究人员从代表5种重要组织器官的小鼠细胞系中分离外泌体。这些细胞系包括3T3-L1细胞 (白色脂肪细胞)、棕色脂肪细胞、C2C12细胞 (骨骼肌细胞)、SVEC细胞 (内皮细胞) 及AML12细胞 (肝脏细胞)。通过提取外泌体中及相应细胞内的miRNA并进行下游检测，研究人员确定了不同类型细胞的miRNA特征，并发现外泌体来源的miRNA和各自细胞来源的miRNA具有显著不同的特征，约三分之一外泌体来源的miRNA具有细胞类型特异性的富集特征，可用于预测其器官组织来源。图2. 使用5种细胞系研究sEVs或细胞来源的miRNA特征通过比较细胞和外泌体内miRNA相对丰度，研究人员确定了miRNA在外泌体和细胞内的差异程度——部分miRNA表现出外泌体富集，而有些miRNA则表现出细胞内富集，即细胞滞留(retention)。进一步分类发现，43个miRNA主要存在于所有细胞类型的细胞内，而13个miRNA则存在于所有细胞类型的外泌体内，这一有趣发现提示，可能存在一种决定miRNA是细胞内滞留还是被分泌入外泌体的适用于所有细胞类型的通用机制。为揭示miRNA富集及分泌的机制，研究人员对表现出仅外泌体富集或仅细胞富集的miRNA进行了序列和结构分析，发现表现出外泌体高富集的miRNA序列具有更高的G+C含量及Gibbs自由能。随后对各个细胞类型深入序列分析，研究人员鉴定出了与外泌体富集显著程度相关的EXOmotifs (各细胞类型具有1-4种该序列，表现出更高的G+C含量)，同时也鉴定出与细胞富集显著相关的CELLmotifs (各个细胞类型具有2-5种该序列，G+C含量较低)。部分序列反复出现在外泌体富集或细胞内富集的miRNA中(无论细胞种类)，该序列具有四核苷酸特征，被研究人员命名为核心EXOmotifs或核心CELLmotifs。这些体外系统鉴定出的miRNA分类特征同样也可以在原代细胞系中得到重复。接下来，为研究调控外泌体分类的序列是否具有改变细胞和外泌体之间miRNA分布的充分性，研究人员引入或移除特定序列以进行突变研究 (图3)。将属于CELLmotifs的AGAAC引入只在外泌体富集的miR-431-5p后能引起该miR 在外泌体中的富集度降低约35%。对本身拥有AGAAC序列的miR-140-3p而言，在该Cellmotif被突变后，其外泌体的转运程度倍增。更显著的是，将miR-677-5p中存在的两个核心CELLmotifs同时突变，能引起该miR在外泌体中的富集程度增加14倍左右。同样类似的结果也可以在核心EXOmotifs突变中得到验证。这些实验结果在其他细胞系中也得到了验证。因此，研究人员鉴定出的这些核心EXOmotifs或核心CELLmotifs能参与miRNA保留或分泌，对其进行引入或移除操控能改变miRNA的分布。图3. 研究人员使用突变实验研究序列功能基于这一现象，研究人员做出假设，认为 EXOmotifs或CELLmotifs可能与特定miRNA结合蛋白相互作用。因此，研究人员开展可基于生物素的pulldown实验 (图4)，将与miRNAs结合的蛋白进行LC-MS/MS蛋白组分析，鉴定出了67个差异表达蛋白。使用siRNA对其中两个蛋白Alyref和Fus进行敲减后，外泌体中含CGGGAG 的miRNA显著减少。因此认为，Alyref和Fus是参与了miRNA序列识别和外泌体转运的两个重要蛋白。研究人员随后也使用了Transwell系统引入特定EXOmotifs至miRNAs以提高其进入外泌体的几率，也验证了分泌后的miRNA能抑制受体细胞的靶基因。图4. 使用pulldown实验验证与特定EXOmotif或CELLmotif相互作用的miRNA结合蛋白本文通过对5种代谢关键的细胞系进行miRNA测序，发现了不同细胞系的外泌体能释放与原细胞系内存在的miRNA显著不同的miRNAs。测序分析发现miRN在外泌体的富集与EXOmotifs (外泌体分泌序列) 和CELLmotifs(细胞保留序列)的存在密切相关。这一发现提示机体存在控制miRNA外泌体富集、分泌和细胞滞留的复杂整合机制 (图5)。对这一机制的深入理解不仅能帮助我们提高调控靶基因表达的miRNA递送效率，还能更好地帮助我们利用将循环miRNA导入至特定组织脏器以治疗重大疾病。因此，本研究提供的调控miRNA在细胞内保留或分泌的机制具有重要的疾病治疗意义。图5. EXOmotifs和CELLmotifs介导的细胞类型特异性的miRNA在外泌体/sEV分泌和细胞保留的机制。哈佛大学医学院Joslin糖尿病中心的Ruben Garcia-Martin博士为本文第一作者，C. Ronald Kahn院士为本文通讯作者。C. Ronald Kahn教授为美国科学院、美国医学科学院、美国科学艺术学院院士，为糖尿病及胰岛素抵抗研究的世界领军人物，培养了100多位遍布世界各地的糖尿病、代谢疾病研究的科学家，其中重要弟子包括哈佛医学院前院长Jeffrey Flier在内的十余位哈佛教授以及担任多个重要研究机构的领军人物，如Eric Verdin (UCSF大学Buck研究所主席、CEO)、Jens Bruning (德国马普代谢研究所所长)等。C. Ronald Kahn教授曾荣获70余个重要国际学术奖项，包括素有“诺奖风向标”之称的沃尔夫医学奖、首届亥姆霍兹糖尿病终身成就奖、美国医师协会George M. Kober奖章，以及美国糖尿病学会(ADA)、美国英国内分泌协会、英国内分泌协会、欧洲糖尿病研究协会、美国临床内分泌医师协会等组织颁发的最高奖等。此外，还C. Ronald Kahn教授领导多个重要学术组织，曾担任美国临床研究学会主席、美国糖尿病学会President-Elect、美国科学院生物医学部门主席、美国国会任命的糖尿病研究工作小组主席、NIDDK战略规划工作组主席等。C. Ronald Kahn教授论文引用达16.5万次，H-index为210，连续多年入选科睿唯安的“高被引科学家”榜。课题组长期致力于多个重要组织脏器的胰岛素信号通路研究，如肝脏、肌肉、脂肪、大脑等，近年来尤其感兴趣利用iPSC研究代谢型疾病中的胰岛素抵抗以及应用miRNA研究不同重要组织间的信号交流，C. Ronald Kahn教授组现有1-2名博士后职位空缺，欢迎有iPSC及miRNA(以及神经代谢)研究背景的研究人员申请。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-021-04234-3

扩散池法是执行半固体剂型制剂的体外释放测试（IVRT）可靠且有重复性的方法。美国药典 (USP) 半固体药品性能测试 (SEMISOLID DRUG PRODUCTS—PERFORMANCE TESTS) 收载有扩散池法的具体测定方法和要求。乳膏是用乳剂型基质制成的软膏剂，具有药物释放和穿透性能好、提高局部药物浓度、不妨碍皮肤正常功能等特点，是临床常用剂型。本文将分享使用扩散池法执行某乳膏制剂的体外释放测试案例，希望能给您带来帮助和启发。测试方法实验仪器：锐拓 RT800 自动取样透皮扩散系统装置：锐拓改良式Franz垂直扩散池温度：32±0.5℃介质：技术保密转速：600 RPM人工膜：技术保密上样量：~0.3g介质体积：30mL取样量/补液量：1mL扩散池孔口直径：15mm扩散池孔口面积：1.77cm 测试过程介质体积称量加入扩散池中的介质重量，并根据测试得到的介质密度，计算各个扩散池中加入的介质体积：根据USP 的要求，测试过程中的所有扩散池应具有相同的体积标称值，并且应测量每个扩散池的真实体积。虽然USP 并没有明确要求介质体积的误差范围，但我们建议介质体积误差应不超过1%。 上样量称重并记录样品装载环中乳膏上样量，并确定上样量均在正常范围之内。=根据USP ，扩散池法测试的样品量一般不小于0.2g。虽然样品的上样量并不参与累积释药量的计算，但超出正常范围的称量数据可以揭示可能发生的样品装载异常，例如有气泡残留在乳膏和滤膜之间。膜的种类半固体制剂体外释放应当选用合适的惰性和商业化的人工膜，常用的有：聚醚砜，醋酸纤维素，尼龙混合酯和聚四氟乙烯膜。其中醋酸纤维素是亲水膜，对有机溶剂不耐受。因此，当释放介质中含有有机溶剂时，另外三种膜是更好的选择。 自动取样根据USP 的要求，应在方法规定的取样时间±2 min范围内完成取样。RT800 自动取样透皮扩散系统，能够自动同时完成6个扩散池的取样，并不存在取样时间差的问题。 测试结果根据 USP ，计算在各个取样时间点每 1平方厘米孔口面积下的累积释药量（Cumulative Amount Released）： 6个测试样品在24小时的累积释药量的相对标准偏差（RSD）为1.53%，本测试的重复性良好。乳膏中药物的释放一般遵循 Higuch 公式，即药物的累积释药量与时间的平方根成正比。将 6 个测试样品在各个取样时间点的累积释药量与取样时间的平方根进行线性回归，得到回归方程和相关系数，并取其斜率值为释药速率常数。 结果讨论结果表明，扩散池法的精密度高，重现性好。可以适用于区分不同乳膏配方的差异，并为乳膏产品的配方开发提供有价值的体外释放度测定数据。得益于锐拓 RT800 自动取样透皮扩散系统的高精度自动化设计，有效地减少实验系统或手动操作引入的误差，让测试结果的重复性更加理想。

2013年3月1日起，欧盟旧版的镍释放标准EN 1811：1998+A1：2008被新版标准EN 1811：2011替代。 　　1. 新旧版标准的比对 　　新版的标准较旧版的标准主要有以下不同： 　　(1) 范围扩大至所有与人体长期接触的物品，以及延伸至刺穿人体的部件 　　(2) 测试溶剂的制备进行测试和有所改变 　　(3) 校正因子0.1被弃用，引入了测试不准的概念，即在不确定的范围内无法断定合格与否 　　(4) 添入了一个新的标准附录C 　　(5) 新版标准EN 1811：2011将太阳镜和眼镜框架排除在外，而太阳镜和眼镜框架的镍的释放测试使用EN 16128：2011。 　　2. 欧盟关于镍释放的规定 　　欧盟在REACH法规的附件XVII中就对于与皮肤长期接触的镍的含量有相应的规定： 　　在由穿刺引起的伤口愈合过程中插入耳孔或人体其他部位的耳钉或其他类似物品，其镍释放量应低于0.2μg/cm2/周 　　与皮肤长期直接接触的制品，如戒指、手镯等其镍释放量应低于0.5μg/cm2/周。 　　3. 业界关注 　　由于校正因子0.1被弃用，引入了测试不准的概念，因此在实际测试中： 　　与皮肤长期直接接触的制品中的镍释放量不大于0.28μg/cm2/周(含0.28μg/cm2/周)时被判定为合格 而当0.28μg/cm2/周含量0.88μg/cm2/周时被判定为结果未知(即不能判断为合格或不合格) 镍释放量大于等于0.88μg/cm2/周时被判定为不合格 　　由穿刺引起的伤口愈合过程中插入耳孔或人体其他部位的耳钉或其他类似物品中的镍释放量不大于0.11μg/cm2/周(含0.11μg/cm2/周)时被判定为合格 而当0.11μg/cm2/周含量0.35μg/cm2/周时被判定为结果未知(即不能判断为合格或不合格) 镍释放量大于等于0.35μg/cm2/周时被判定为不合格。 　　4. 相关知识 　　镍是一种常见的金属，在饰品中常以镀层或合金的形式存在。与皮肤长期接触的过程中，这些产品释放的镍可能会导致皮肤过敏甚至皮炎。慢性吸入镍可导致心、脑、肝等退变。