睾丸酮

在北京冬奥会的精彩的比赛之外，也有一些不和谐的消息传来：作为围观群众，你可能经常在与兴奋剂有关的新闻中听到“血检”“尿检”等字眼，但是，兴奋剂到底是怎么被检测出来的？在2022冬奥会中，北京冬奥组委会又使用了什么检测兴奋剂的新手段呢？兴奋剂检测：色谱+质谱经过与兴奋剂数十年的斗争，目前国际上对兴奋剂分子的检测、甄别技术已经越发健全了。虽然北京冬奥组委会尚没有公布本次奥运会检测兴奋剂的具体方法，但我们可以从历次大型体育赛事的常规检测方法中知晓兴奋剂检测的原理。常规来讲，体育赛事中兴奋剂的检测大多是先将运动员生物样本中的各种分子萃取、分离，然后再依次确定这些分子“身份”。虽然从运动员身上取来的样品一般都是液体样品，如血液，尿液，汗液等，但在检测的过程中，实际上是分了气体、液体两条赛道的。尿液是最常用到的检测标本，而血液样品主要用于检测那些一般不容易进入尿液里的分子，如生长激素、红细胞生成素等蛋白/糖蛋白类激素，以及外源性红细胞等可以提高在赛事中表现力的活性生物制品。尿液中一部分较容易挥发的分子（如一部分小分子类固醇类兴奋剂）会参加气体赛道的检测，而血液以及尿液中剩下的那些分子量比较大且表现较为“老实”的分子则会出现在液体检测的赛道中。目前兴奋剂分析的大致流程检测step 1——色谱分离不同分子虽然赛道不尽相同，但在气体与液体赛道中不同分子的检测过程却殊途同归。这两种检测方式的第一步都是先将复杂样品中所含有的各种分子分隔开，让它们乖乖排队站好。液相色谱/气相色谱技术（A）典型的液相色谱结构示意图，其中横向柱状者为LC分离柱。（B）气相色谱结构简图，其中状如线圈者为GC分离柱。（C）一种以芯片式集成于硅片表面的微型GC分离柱。通过样品中不同分子的分子质量、所带电荷、亲疏水性等物理特征的区别，可以将不同的分子以一定的规律分开，这种方法被称为“色谱”（Chromatography）。这就好比让这些分子跑一个漫长的马拉松，然后通过漫长的路程区分出它们“耐力”的区别。色谱的名字其实是源于百年前用碳酸钙从树叶提取物中分离不同植物色素的俄国植物学家米哈伊尔茨维特（Михаил Семёнович Цвет）。相信这个实验，不少朋友在初高中生物课上就已经学习并体验过了（用滤纸从树叶汁中分离出叶绿素A，叶绿素B，叶黄素和β胡萝卜素）。但在今天，运用色谱技术来分离分子的物理特征中倒是很少包括分子颜色等光学特征了。在现代色谱仪中用来分离分子的原件，叫做分离柱，现在一般被“生化环材实验狗”们称为柱子。一般来讲就是一根细长管道中填满了能与分子发生作用的填料。液相色谱(Liquid Chromatography, LC)中使用的柱子看起来较为短粗（长度一般不超过一米），而在气相色谱(Gas Chromatography, GC)中，由于气体分子与填料的相互作用较弱，分离不同分子所需的填料距离往往需要5-10米甚至更长。因为这个原因，气相色谱的分离柱看起来其实更像一团线圈。一台比较典型的质谱分析仪检测step 2——质谱仪验明正身不管是样品中的液体分子还是气体分子，它们在通过色谱仪实现不同分子的分离之后，面临的下一道关卡都是能够给它们“验明正身”的质谱仪(MS)。质谱仪可以将色谱分离纯化后的分子进行电离，然后分析它们的“特征指纹”——质谱，从而确定这个分子的真实身份。值得注意的是，目前在兴奋剂检测领域里有多种不同且常见的质谱技术，它们都有自己的独门绝技。例如主要用于检测痕量兴奋剂的DFS 高分辨双聚焦磁质谱和主要用于区分内源性和外源性睾丸酮的DELTA V 同位素质谱等（人工合成的睾丸酮往往具有更高的碳同位素一致性，而人体自己产生的睾丸酮分子内的碳原子会含有一部分C13或C14）。说到睾丸酮，其实还有一段很惊险的旧事，就发生在我们非常熟悉的“不懂球的胖子”——刘国梁身上。1999年世乒赛上，刘国梁被查出血清表睾酮（一种睾丸酮变体）偏高，被怀疑是服用了外源性的兴奋剂，险些被禁赛。但实际上，他的血清睾丸酮水平异常是他自己的生理情况导致的（也许天生骨骼清奇？），并非服用兴奋剂。当时正是靠同位素质谱这一新技术以及国际乒联的多次飞行抽检，才让刘国梁洗清了冤屈。虽然目前色谱+质谱(LC-MS/GC-MS)联用法仍然是兴奋剂检测的黄金标准，但其它一些技术也在这些年逐渐崭露头角。如基于微流控免疫分析的汗液中特殊分子（毒品、兴奋剂等）快检技术（可在20-30分子内完成测试），针对一些常见兴奋剂（如麻黄碱类）的ELISA免疫分析试剂盒，走电化学、毛细管电泳等技术路线的兴奋剂检测技术等等。北京冬奥会：干血点技术首次正式使用不光是检测技术，运动员样品的运输保存技术、样品提取技术对非法兴奋剂的有效检出也有很大的影响。正如前文所说，传统意义上运动员的生物检材一般包括血液/血清以及尿液。为了防止尿样/血样中的兴奋剂分子被水解或在酶的影响下失活，样本的储存运输条件相当苛刻，比如，样本需要在冷藏（4︒C）的环境下尽快送检，而需要长期储存的样品则必须被维持在-20︒C之下。2020年，国际兴奋剂检测机ITA还专门设立了一个用以长期储存样品的保存设施，可将运动员身上采集的各类标本保存十年以上。此外，样品运输到实验室之后，还需要经过比较复杂的萃取流程，在排除掉细胞与蛋白的干扰后，才能进入色谱/质谱检测的流程。在三种不同滤纸上的干血点。血液滴在试纸上后会在30分钟左右的时间内逐渐干燥。但一般为保险起见，风干时间至少为2小时在经过东京奥运会的试验之后，北京冬奥会的兴奋剂检测流程中正式纳入了一种新的样本采集/运输技术——干血点（Dry Blood Spot, DBS）技术。其实这个技术说起来非常容易理解。就是将运动员的一滴血液（可为静脉血/指尖血）滴在滤纸（或硝酸纤维素膜）上，待其自然风干两三个小时即可制成。干血点技术并不是什么新技术，它曾在人类与艾滋病、乙型/丙型肝炎、疟疾等传染病的斗争中起到了很大的作用，尤其是在欠发达地区病人的样本采集活动中被广泛应用。单纯针对兴奋剂检测而言，在干血点风干的过程中，不仅样品中兴奋剂小分子的浓度可以得到浓缩，同时血液中所含的细胞也会失水而死。由于没有了水和酶的干扰，干血点样品便非常稳定，可以在室温条件下保存数日乃至数周。也就是说，在未来的奥运会中，甚至可以不用携带保温设备，仅通过信封这种简单的封装方式就能运输样品。与此同时，由于干血点样品中几乎不含水份，因此在使用甲醇等特殊有机溶剂时更有利于一些疏水性有机物的萃取。这些技术优点都有助于提高兴奋剂在后续气相色谱/液相色谱/质谱等测试中的检出能力。结语俗话说，道高一尺魔高一丈，即便是拥有了这么多反兴奋剂的先进技术和设备，还是有少数运动员会铤而走险服用兴奋剂。要想保证竞赛完全公平，仍然是一项非常难做到的任务，反兴奋剂还需要各方共同努力。

前几天，中国游泳运动员潘展乐以46秒40的成绩获得奥运会男子100米自由泳冠军，为中国游泳首夺该项目奥运会金牌，并打破自己保持的世界纪录，国人为之激动不已，而一则令人不解和气愤的消息也同时广为人知：中国运动员普遍遭受了国际兴奋剂检测组织前所未有的高强度兴奋剂检测！为什么在奥运会上兴奋剂检测会受到“特殊关注”？原来，兴奋剂的摄入防不胜防。2022年10月6日。在中国反兴奋剂中心进行日常的赛外兴奋剂检查时，有两个中国游泳运动员被发现其尿样中含有一种名为美雄酮的代谢物，浓度非常低。这一发现着实让大家大吃一惊！经过细致调查，真相大白：这两位运动员完全不知情地在外就餐时，食用了被美雄酮污染的肉类食品。这就像你在麦当劳吃了一个汉堡，却不慎吃到混入的兴奋剂，谁能预料到这种情况呢！很多人不知道，最困扰运动员的是食源性兴奋剂。什么是食源性兴奋剂？食源性兴奋剂是指来源于食品中的兴奋剂，包括一般性食品及保健食品中从生产到加工过程中天然存在或使用、添加而残留的兴奋剂成分。天然存在兴奋剂成分的如：莲子和莲子心中天然存在的生物碱类物质具有一定镇静、抗心律失常作用；中药材中的甘草能发挥类固醇激素作用；去甲乌药碱属于苄基异喹啉类生物碱，存在于植物如花椒、莲子及释迦果等中。一般来说，天然存在于食品的兴奋剂比较容易识别，而畜禽肉中兴奋剂的来源却十分复杂。由于传统畜禽的饲养方式已经改变，养殖过程中使用的抗生素和激素类药物在畜禽肉中可能存在残留，如瘦肉精类，甚至饲料中存在的一些兴奋剂可能因畜禽的食用而残留在畜禽体内。为了避免误食食源性兴奋剂，国家体育总局对国家队运动员的外出就餐做出了一些限制和规定，以确保运动员在饮食上不会不小心触碰到兴奋剂的红线。运动员真的没有什么可以吃的了｜图源:运动员冯喆微博兴奋剂检测方式在奥运会的赛场上，运动员需遵守严格的反兴奋剂规定。那么，是否意味着比赛期间不吃这些易含兴奋剂的食物就可以呢？其实，即便是在非比赛期也必须保持极高的警惕。反兴奋剂机构执行的赛内和赛外检测是确保公平竞争的关键措施。赛外检测，又称“飞检”，允许检测官员在任何时间对注册运动员进行突击检查。高水平运动员和来自竞技体育强国的选手更容易成为此类检测的目标。这种检测方式的目的是为了杜绝使用提高成绩的非法手段，维护体育竞赛的公正性。尿检作为主要的检测方式，要求运动员在官员的直接监视下提供样本，这一过程对于个人隐私而言无疑是一种挑战。然而，这是国际体育赛事中普遍接受的做法，旨在防止操纵结果的行为发生。若运动员无故拒绝或拖延检测，将面临处罚甚至被认定为兴奋剂检测阳性。需要补充说明的是，不同兴奋剂在体内的代谢周期差异显著，从数小时到数月不等。这意味着，即便是非比赛期间不慎摄入含兴奋剂的食品，也可能在随后的赛内检测中呈阳性反应。因此，运动员必须长期严格控制饮食，避免食用可能受污染的食物。除了尿检，还有血检，在经过东京奥运会的试验之后，2022年，北京冬奥会的兴奋剂检测流程中正式纳入了一种新的样本采集/运输技术——干血点（Dry Blood Spot, DBS）技术。其实这个技术说起来非常容易理解。就是将运动员的一滴血液（可为静脉血/指尖血）滴在滤纸（或硝酸纤维素膜）上，待其自然风干两三个小时即可制成。常用的检测仪器：色谱仪+质谱仪常规来讲，体育赛事中兴奋剂的检测大多是先将运动员生物样本（尿液、血液、干血点）中的各种分子萃取、分离，然后再依次确定这些分子“身份”。检测step 1——色谱分离不同分子。第一步都是先将复杂样品中所含有的各种分子分隔开，让它们乖乖排队站好。在现代色谱仪中用来分离分子的原件，叫做分离柱，现在一般被“生化环材实验狗”们称为柱子。一般来讲就是一根细长管道中填满了能与分子发生作用的填料。液相色谱(Liquid Chromatography, LC)中使用的柱子看起来较为短粗（长度一般不超过一米），而在气相色谱(Gas Chromatography, GC)中，由于气体分子与填料的相互作用较弱，分离不同分子所需的填料距离往往需要5-10米甚至更长。因为这个原因，气相色谱的分离柱看起来其实更像一团线圈。检测step 2——质谱仪验明正身。不管是样品中的液体分子还是气体分子，它们在通过色谱仪实现不同分子的分离之后，面临的下一道关卡都是能够给它们“验明正身”的质谱仪(MS)。质谱仪可以将色谱分离纯化后的分子进行电离，然后分析它们的“特征指纹”——质谱，从而确定这个分子的真实身份。值得注意的是，目前在兴奋剂检测领域里有多种不同且常见的质谱技术，它们都有自己的独门绝技。例如主要用于检测痕量兴奋剂的DFS 高分辨双聚焦磁质谱和主要用于区分内源性和外源性睾丸酮的DELTA V 同位素质谱等（人工合成的睾丸酮往往具有更高的碳同位素一致性，而人体自己产生的睾丸酮分子内的碳原子会含有一部分C13或C14）。更详细的介绍，可见：北京冬奥会怎么用色谱+质谱检测兴奋剂？参考资料：中国反兴奋剂中心发布关于涉及中国游泳运动员美雄酮代谢物阳性案件的声明.新华社，2024年7月31日

2024年1月8日，根据《化妆品监督管理条例》，国家药监局批准发布《化妆品中非那雄胺等10种组分的测定》化妆品补充检验方法。非那雄胺为一种4-氮杂甾体化合物，能有效地减少血液和前列腺内的二氢睾丸酮，用于治疗前列腺增生症。但是妇女、儿童和对本品过敏者禁用非那雄胺。本标准的起草单位为上海市食品药品检验研究院起草，验证单位为山东省食品药品检验研究院、广东省药品检验所和江西省药品检验检测研究院。本标准规定采用高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪测定化妆品中羟基氟他胺、非那雄胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、氟罗地尔、氟他胺、环丙孕酮、醋酸环丙孕酮、度他雄胺、依立雄胺的含量，适用于膏霜乳类、液体类（水、油）、凝胶类、蜡基类、粉剂类化妆品中非那雄胺等10种组分的定性和定量测定。详细检测方法详见附件。附件：《化妆品中非那雄胺等10种组分的测定》