睾丸凋亡基因抗体

[align=center]抗肿瘤单克隆抗体药物的研究进展[/align][align=center] [/align][align=center]摘　　要[/align][align=center] [/align]　通过淋巴细胞杂交瘤技术或基因工程技术制备单克隆抗体药物,已经成为生物制药领域的一个重要方面,特别是对抗肿瘤单克隆抗体药物的研究已获得了重要进展。多年来,许多研究证实了抗肿瘤单克隆抗体药物的作用,为其应用于肿瘤治疗提供了重要依据。这类药物的特异性强，疗效显著。本文主要就近年来抗肿瘤单克隆抗体药物的研究进展进行了综述，并对抗肿瘤单克隆抗体药物的发展前景进行了展望。[align=left] [/align][align=left]关键词：抗肿瘤；单克隆抗体；研究进展[/align][align=center] [/align][align=center] [/align][b]一 引言[/b]抗肿瘤单抗药物因与烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、铂类配合物、植物药等抗肿瘤药物相比,具有高效价、高特异性、血清交叉反应少等特点与优点,在肿瘤治疗中起着不可替代的作用。单抗药物是当前生物技术药物领域甚为活跃的部分。针对特定的分子靶点(抗原),单抗有高度特异性。针对各种不同的抗原,可以制备为数众多的、各不相同的单抗；因此,作为药物来源,单抗又具有高度多样性。由于其特异性和多样性,研制单抗药物有巨大的潜力。单克隆抗体药物治疗恶性瘤主要机制有两种[sup][/sup]:一是利用单克隆抗体本身来阻断癌细胞生长的信号,单克隆抗体在癌细胞膜外与生长因子竞争结合受体,阻断信号传递过程,从而阻止癌细胞的生长和扩散,诱导细胞凋亡或者间接激活宿主的抗肿瘤免疫反应；二是利用单克隆抗体作为药物载体的靶向治疗,如将有细胞毒性的药物或有放射性的药物靶向性的运送到肿瘤细胞,从而杀伤肿瘤细胞。目前,国际上与肿瘤治疗相关的抗体研究主要集中在将抗体与耦联物作用后直接杀伤肿瘤细胞,利用抗体促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤血管生成等方面。此外，研究表明静脉内注射抗肿瘤单抗,在肿瘤部位的浓度较高,显示特异性定位；单抗与药物的偶联物通常仍保留原来单抗的分布特征,在靶肿瘤的浓度较高[sup][/sup]。[align=center]二　　单克隆抗体药物作用靶点[/align]特定受体或特定的基因表达蛋白可能作为单抗药物的靶点。Rituxan是以B细胞的CD20分子作为靶点的人鼠嵌合抗体,对非霍奇金氏B细胞淋巴瘤有疗效,是第一个获美国FDA批准用于治疗恶性肿瘤的单抗。Herceptin是抗HER-2/neu癌基因编码蛋白的单抗,临床研究对乳腺癌有效,与化疗药物联合有更显著的疗效。Mylotarg是由抗CD33单抗与calicheamicin构成的偶联物,已获批准用于治疗急性复发性髓性白血病[sup][/sup]。表皮细胞生长因子受体(EGFr)在人的鳞癌、乳腺癌和脑胶质瘤等均有较高的表达。有报道,抗EGFr单抗与长春碱衍生物的偶联物在裸鼠体内试验,显示良好的抗癌效果。抗EGFr的人鼠嵌合抗体已进入临床研究。血管内皮生长因子(VEGF)在血管生成中有重要作用。据报道,抗VEGF的中和性单抗具有广谱的抗肿瘤作用,对移植于裸鼠的人体癌瘤有显著疗效[sup][/sup]。[b]三 单抗诱发肿瘤细胞凋亡[/b][align=left] 3.1 通过免疫细胞表面抗原的交联作用而诱导恶性肿瘤细胞的凋亡[/align]用于治疗血液系统恶性肿瘤的单克隆抗体药物大多是通过免疫细胞表面抗原的交联作用诱导恶性肿瘤细胞凋亡而起作用的,如目前用的抗-CD20的单克隆抗体——美罗华。其单克隆抗体的作用机制是通过诱导CD20分子在B细胞膜上的脂筏区聚集,再在一系列激酶的作用下使脂筏信号传导区域的CD20分子亲和性增强,从而形成CD20交联形式；交联的CD20分子启动了细胞内凋亡信号的传导通路,使线粒体释放出细胞色素C,激活下游的caspase级联反应,最终导致细胞凋亡[sup][/sup]。3.2 作用于恶性肿瘤细胞膜上的生长因子及其受体而诱导细胞凋亡许多生长因子及其受体通过作用于细胞的存活途径、刺激细胞的有丝分裂、促进细胞的生长增殖来阻止细胞凋亡。与正常细胞中生长因子信号传导的严格调控相比,肿瘤细胞中的失控则导致细胞的恶性增殖,从而使恶性细胞获得“永生”。单克隆抗体通过作用于恶性肿瘤细胞膜上的生长因子及其受体可阻断存活信号传导通路,从而导致其凋亡,同时还能对化疗和放疗有正协同作用。目前主要集中在对血管内皮生长因子(VEGF)及其受体、表皮生长因子受体(EGFR)等的研究。美国FDA于2006年批准了第一个用于治疗头颈部鳞状细胞癌的单克隆抗体药物——Cetuximab,它为一种IgG1单克隆抗体,主要通过干扰癌细胞表面EGFR的生长,从而减少癌细胞进入正常组织的概率,控制癌细胞的转移,达到抗癌目的[sup][/sup]。最初想到制备针对恶性肿瘤凋亡相关分子的单克隆抗体药物时,虽然从理论上来说无疑是给人们注入了一针兴奋剂,但在实际应用中则并不然,所以在通过单克隆抗体药物诱导恶性肿瘤细胞凋亡的研究和治疗中,还有待进一步开发新的、更经济、更有效地药物。[b]四　 单克隆抗体耦联物[/b]4.1 抗体与化疗药物耦联目前,国内外研究较多的与单克隆抗体耦联的化学药物有平阳霉素、柔红霉素、丝裂霉素、多柔比星(阿霉素)、顺铂以及长春碱类衍生物等。同时还可以通过脂质体靶向制剂作为化疗药靶向治疗肿瘤,利用脂质体制剂将药物导向靶标进行有选择性地杀伤癌细胞和抑制癌细胞的繁殖,以达到提高疗效和高度定向作用。目前已上市的脂质体有复方氟脲嘧多相脂质体、喜树碱多相脂质体、阿霉素脂质体和紫杉醇脂质体等。4.2 抗体导向酶耦联利用抗体与肿瘤细胞表面抗原的特异性结合,将前体药物的专一性活化酶与单抗耦联,导向输入到靶细胞部分,再注入前体药物,使其在酶的作用下转化为活性药物,进而杀伤肿瘤细胞[sup][/sup]。目前这种用作前体药物的抗癌药有苦杏仁苷、氮芥、鬼臼乙叉苷、阿霉素、丝裂霉素等。而作为活化前体药物的导向酶有碱性磷酸酶、青霉素V或G酰胺酶、羧基酶肽、胸腺嘧啶核苷酶、β葡萄苷酶等。临床研究表明，单抗耦联物对于抗药性肿瘤细胞仍显示较强的杀伤活性。对由于长期使用氨甲蝶呤而出现抗药性的成骨肉瘤细胞,单抗氨甲蝶呤耦联物仍显示较强的杀伤作用。对于具有多药抗药性(MDR)的肿瘤细胞,抗P-170糖蛋白单抗构成的免疫毒素可显示选择性杀伤作用[sup][/sup]。这说明,单抗药物有可能用于克服肿瘤细胞抗药性。[b]五　　单克隆抗体靶向药物[/b]单抗靶向药物是利用单抗对肿瘤表面相关抗原或特定的受体特异性识别,从而把药物直接导向肿瘤细胞,提高药物的疗效,降低药物对循环系统及其他部位的毒性。研究表明,单抗靶向药物具有很好的疗效,在免疫偶联物对移植于裸鼠的相应人体肿瘤生长有抑制作用。免疫偶联物与相应的游离物比较,具有更高更好的疗效和较低的细胞毒性[sup][/sup]。单克隆抗体体积小,能更有效地透入肿瘤；分子小、消除快、累积毒性小；所携带的弹头脱离后,可较快被清除 循环中免疫靶向结合物对靶细胞的竞争作用小；半衰期短；穿透性好；能穿过血脑屏障[sup][/sup],因而还可以作为新一代靶向载体。与化学药物、毒素、放射性核素、生物因子、基因、分化诱导剂、光敏剂、酶等物质构成单克隆抗体靶向药物,把杀伤肿瘤细胞的活性物质特异的输送到肿瘤部位,利用单抗对肿瘤表面相关抗原或特定的受体特异性识别,从而把药物直接导向肿瘤细胞,提高药物疗效,降低药物对循环系统及其他部位的毒性。近年来,随着医学、药学和生物工程学及技术的进步,临床对肿瘤的根治和对癌细胞的攻击锁定于表皮生长因子和血管内皮生长因子等靶位,使药物治疗的切入点由细胞水平提升到分子和抗体水平,从而提高了肿瘤综合治疗的效果。[align=center]六　　人源化单克隆抗体[/align]单克隆抗体是近年竞相开发的品种,自1997年第1个单克隆抗体rituximab通过食品与药物管理局(FDA)批准应用于临床以来,目前已经上市的单克隆抗体靶向药物的疗效令人瞩目,在抗肿瘤、类风湿性关节炎和自身免疫系统缺陷治疗领域得到了有力的推广,其以独特的作用优势,在肿瘤的治疗中不但能够选择性杀伤癌细胞,且在体内表现出特异的分布特性,具有高效、低毒的特点,从而在生物技术产品领域中占据了1/3的市场[sup][/sup]。目前用于治疗肿瘤的单克隆抗体药已有多个,包括伊珠单抗奥加米星、帕尼单抗、曲妥珠单抗等。伊珠单抗奥加米星又名CMC-544，是以人源化抗CD22的抗体伊珠单抗与 CalichDMH偶联形成的ADC药物，用来治疗复发性或难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤（B cell-NHL）和急性淋巴细胞白血病（ALL），目前已经进入临床 III期试验[sup][/sup]。帕尼单抗是一种IgG2单克隆抗体完全人源化可以与EGFR高度特异性地结合，进而阻断配体诱导的信号激活，从而抑制肿瘤生长。有临床研究选择既往未治疗过的ⅢB或Ⅳ期非小细胞肺癌患者比较卡铂(AUC=6，每3周)，加紫杉醇(200mg/m21次/3周) 联合或不联合帕尼单抗(2.5 mg/m2，1次/周) 化疗的疗效及其安全性。研究结果显示，单纯化疗组与帕尼单抗联合化疗组之间在PFS(5.3个月对比4.2个月、P=0.55)和总生存( Overall survival，OS)(8.0个月对比8.5个月，P =0.81)上均无显著差异。结果提示帕尼单抗联合一线化疗方案可能对晚期非小细胞肺癌无明显疗效[sup][/sup]。曲妥珠单抗是一种抗Her2的单克隆抗体，他可以和肿瘤细胞的HER2/neu特异性地结合，从而阻断细胞内生长信号的转导，同时曲妥珠单抗还可以诱导体内巨噬细胞以及自然杀伤细胞攻击肿瘤细胞，以达到抑制和杀伤肿瘤细胞的目的。比较用或不用曲妥珠单抗联合一线化疗方案用以治疗ⅡB/Ⅲ期HER2/neu阳性的 NSCLC患者差异的两项大型的随机Ⅱ期临床试验，其结果显示两个试验结论相似，曲妥珠单抗不能提高化疗的疗效,但也不加重化疗的不良反应。试验中HER2/neu值为3+的患者对曲妥珠单抗治疗的反应性较好，提示曲妥珠单抗对这一较少见类型的NSCLC效果要更好[sup][/sup]。在临床治疗中使用鼠派生单抗的主要障碍之一是产生人抗鼠抗体(HAMA)反应,通过基因工程技术制备嵌合抗体的I-IPdVIA反应率较鼠源性单抗低,但完全的人源抗体才是单抗药物的发展目标。噬茵体抗体库技术和转基因小鼠技术是制备完全人源单抗的两种方法[sup][/sup]。因此,只有不断地完善单克隆抗体人源化的技术,才能更好地将完全人源化的单克隆抗体用于肿瘤分子靶向治疗中,从而使医学界迈向更高的台阶。[b]七　　问题与对策[/b]在限制单克隆抗体临床治疗效果的因素有:(l)循环免疫复合物导致的肝肾功能损害。(2)可溶性肿瘤抗原释放造成的体液中的封闭作用。(3)异种蛋白反应。(4)特异性还不够专一,引起了正常细胞的伤害。(5)天然免疫功能低下(如补体介异的细胞毒,网状内皮系统清除和ADCC作用等)。(6)主要的问题还在这种免疫疗法会导致靶细胞(肿瘤细胞)上抗原的转换。为了解决这些问题,今后的研究应着重:(1)制备对肿瘤抗原有高度特异性的单克隆抗体。(2)选择不易诱导抗原转换的单克隆抗体。(3)研究副作用较少,既安全疗效又高的偶联制剂。单抗（Mab）药物存在的一个最关键问题就是人抗鼠抗体反应（HAMA）。由于用于临床研究的Mab药物一般使用鼠源Mab,这不可避免地会引起HAMA反应,所以尽量避免HAMA反应这一副作用才是Mab药物能否真正适合治疗肿瘤性疾病的重点[sup][/sup]。近些年来,Mab药物的研究主要是向减轻宿主对外源抗体的排斥,促进抗体人源化,改变抗体的氨基酸序列而增加或降低该抗体的生物学效应,加抗体的亲和力,制备双特异性抗体,改造抗体重链恒定区以增强抗体功能,以及寻找新的分子靶点(相对特异的肿瘤抗原)等方向发展[sup][/sup]。Mab药物的不断更新,必将为全球的肿瘤患者带来更大的希望。[align=center]八　　总结与展望[/align]目前肿瘤治疗中使用最广泛的仍是化疗以及放射性疗法,其毒副作用较大。随着基因工程技术和DNA重组技术的兴起,利用单克隆抗体治疗肿瘤已经日渐取代副作用较大的传统疗法而成为新的发展趋向。所以,如何研制更多的单克隆抗体以及怎样更好的利用单克隆抗体治疗肿瘤,将成为肿瘤治疗研究中的又一艰巨任务。同时,生物技术以及抗肿瘤化学药物的发展也必将推动单抗药物的发展与进步,单克隆抗体药物将在各种肿瘤的治疗中发挥越来越重要的作用。在未来10年内,单克隆抗体药将成为国内、外生物药品发展的主旋律。此外，利用与肿瘤细胞相关抗原的特异结合力,相应的单克隆抗体可以用于肿瘤早期诊断和预后判定。例如用放射标记抗体能够确定肿瘤存在的位置,扩散的部位和范围,以便确定手术时机和化疗方案。通过测定抗体结合白血病细胞的增减,可以检查白血病的化疗效果[sup][/sup]。利用单克隆抗体检测某些癌的特异性产物,如前列腺癌产生的酸性磷酸酶,绒毛膜上皮癌产生的促性腺激素,结肠癌产生的癌胚抗原及肝癌产生的甲胎蛋白等,有助于癌肿的早期诊断[sup][/sup]。单克隆抗体在肿瘤的治疗中的作用功不可没，但同时也面临着巨大的挑战，例如如何选择优势人群、进一步提高疗效、降低不良反应的发生都是需要进一步解决的。如贝伐单抗的突出不良反应是出血，在NCCN指南中特别指出贝伐单抗仅适用非鳞癌的[sup][/sup]，既往无咯血史的患者，限制了贝伐单抗的临床应用。而其他大部分单克隆抗体均需与其他化疗药物联用，单独应用的疗效仍有限，选择合适的指标以及合适人群应用单克隆抗体仍任重而道远。[b]参考文献[/b] 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[align=center]抗肿瘤单克隆抗体药物的研究进展[/align][align=center] [/align][align=center]摘　　要[/align][align=center] [/align]　通过淋巴细胞杂交瘤技术或基因工程技术制备单克隆抗体药物,已经成为生物制药领域的一个重要方面,特别是对抗肿瘤单克隆抗体药物的研究已获得了重要进展。多年来,许多研究证实了抗肿瘤单克隆抗体药物的作用,为其应用于肿瘤治疗提供了重要依据。这类药物的特异性强，疗效显著。本文主要就近年来抗肿瘤单克隆抗体药物的研究进展进行了综述，并对抗肿瘤单克隆抗体药物的发展前景进行了展望。[align=left] [/align][align=left]关键词：抗肿瘤；单克隆抗体；研究进展[/align][align=center] [/align][align=center] [/align][b]一 引言[/b]抗肿瘤单抗药物因与烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、铂类配合物、植物药等抗肿瘤药物相比,具有高效价、高特异性、血清交叉反应少等特点与优点,在肿瘤治疗中起着不可替代的作用。单抗药物是当前生物技术药物领域甚为活跃的部分。针对特定的分子靶点(抗原),单抗有高度特异性。针对各种不同的抗原,可以制备为数众多的、各不相同的单抗；因此,作为药物来源,单抗又具有高度多样性。由于其特异性和多样性,研制单抗药物有巨大的潜力。单克隆抗体药物治疗恶性瘤主要机制有两种[sup][/sup]:一是利用单克隆抗体本身来阻断癌细胞生长的信号,单克隆抗体在癌细胞膜外与生长因子竞争结合受体,阻断信号传递过程,从而阻止癌细胞的生长和扩散,诱导细胞凋亡或者间接激活宿主的抗肿瘤免疫反应；二是利用单克隆抗体作为药物载体的靶向治疗,如将有细胞毒性的药物或有放射性的药物靶向性的运送到肿瘤细胞,从而杀伤肿瘤细胞。目前,国际上与肿瘤治疗相关的抗体研究主要集中在将抗体与耦联物作用后直接杀伤肿瘤细胞,利用抗体促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤血管生成等方面。此外，研究表明静脉内注射抗肿瘤单抗,在肿瘤部位的浓度较高,显示特异性定位；单抗与药物的偶联物通常仍保留原来单抗的分布特征,在靶肿瘤的浓度较高[sup][/sup]。[align=center]二　　单克隆抗体药物作用靶点[/align]特定受体或特定的基因表达蛋白可能作为单抗药物的靶点。Rituxan是以B细胞的CD20分子作为靶点的人鼠嵌合抗体,对非霍奇金氏B细胞淋巴瘤有疗效,是第一个获美国FDA批准用于治疗恶性肿瘤的单抗。Herceptin是抗HER-2/neu癌基因编码蛋白的单抗,临床研究对乳腺癌有效,与化疗药物联合有更显著的疗效。Mylotarg是由抗CD33单抗与calicheamicin构成的偶联物,已获批准用于治疗急性复发性髓性白血病[sup][/sup]。表皮细胞生长因子受体(EGFr)在人的鳞癌、乳腺癌和脑胶质瘤等均有较高的表达。有报道,抗EGFr单抗与长春碱衍生物的偶联物在裸鼠体内试验,显示良好的抗癌效果。抗EGFr的人鼠嵌合抗体已进入临床研究。血管内皮生长因子(VEGF)在血管生成中有重要作用。据报道,抗VEGF的中和性单抗具有广谱的抗肿瘤作用,对移植于裸鼠的人体癌瘤有显著疗效[sup][/sup]。[b]三 单抗诱发肿瘤细胞凋亡[/b][align=left] 3.1 通过免疫细胞表面抗原的交联作用而诱导恶性肿瘤细胞的凋亡[/align]用于治疗血液系统恶性肿瘤的单克隆抗体药物大多是通过免疫细胞表面抗原的交联作用诱导恶性肿瘤细胞凋亡而起作用的,如目前用的抗-CD20的单克隆抗体——美罗华。其单克隆抗体的作用机制是通过诱导CD20分子在B细胞膜上的脂筏区聚集,再在一系列激酶的作用下使脂筏信号传导区域的CD20分子亲和性增强,从而形成CD20交联形式；交联的CD20分子启动了细胞内凋亡信号的传导通路,使线粒体释放出细胞色素C,激活下游的caspase级联反应,最终导致细胞凋亡[sup][/sup]。3.2 作用于恶性肿瘤细胞膜上的生长因子及其受体而诱导细胞凋亡许多生长因子及其受体通过作用于细胞的存活途径、刺激细胞的有丝分裂、促进细胞的生长增殖来阻止细胞凋亡。与正常细胞中生长因子信号传导的严格调控相比,肿瘤细胞中的失控则导致细胞的恶性增殖,从而使恶性细胞获得“永生”。单克隆抗体通过作用于恶性肿瘤细胞膜上的生长因子及其受体可阻断存活信号传导通路,从而导致其凋亡,同时还能对化疗和放疗有正协同作用。目前主要集中在对血管内皮生长因子(VEGF)及其受体、表皮生长因子受体(EGFR)等的研究。美国FDA于2006年批准了第一个用于治疗头颈部鳞状细胞癌的单克隆抗体药物——Cetuximab,它为一种IgG1单克隆抗体,主要通过干扰癌细胞表面EGFR的生长,从而减少癌细胞进入正常组织的概率,控制癌细胞的转移,达到抗癌目的[sup][/sup]。最初想到制备针对恶性肿瘤凋亡相关分子的单克隆抗体药物时,虽然从理论上来说无疑是给人们注入了一针兴奋剂,但在实际应用中则并不然,所以在通过单克隆抗体药物诱导恶性肿瘤细胞凋亡的研究和治疗中,还有待进一步开发新的、更经济、更有效地药物。[b]四　 单克隆抗体耦联物[/b]4.1 抗体与化疗药物耦联目前,国内外研究较多的与单克隆抗体耦联的化学药物有平阳霉素、柔红霉素、丝裂霉素、多柔比星(阿霉素)、顺铂以及长春碱类衍生物等。同时还可以通过脂质体靶向制剂作为化疗药靶向治疗肿瘤,利用脂质体制剂将药物导向靶标进行有选择性地杀伤癌细胞和抑制癌细胞的繁殖,以达到提高疗效和高度定向作用。目前已上市的脂质体有复方氟脲嘧多相脂质体、喜树碱多相脂质体、阿霉素脂质体和紫杉醇脂质体等。4.2 抗体导向酶耦联利用抗体与肿瘤细胞表面抗原的特异性结合,将前体药物的专一性活化酶与单抗耦联,导向输入到靶细胞部分,再注入前体药物,使其在酶的作用下转化为活性药物,进而杀伤肿瘤细胞[sup][/sup]。目前这种用作前体药物的抗癌药有苦杏仁苷、氮芥、鬼臼乙叉苷、阿霉素、丝裂霉素等。而作为活化前体药物的导向酶有碱性磷酸酶、青霉素V或G酰胺酶、羧基酶肽、胸腺嘧啶核苷酶、β葡萄苷酶等。临床研究表明，单抗耦联物对于抗药性肿瘤细胞仍显示较强的杀伤活性。对由于长期使用氨甲蝶呤而出现抗药性的成骨肉瘤细胞,单抗氨甲蝶呤耦联物仍显示较强的杀伤作用。对于具有多药抗药性(MDR)的肿瘤细胞,抗P-170糖蛋白单抗构成的免疫毒素可显示选择性杀伤作用[sup][/sup]。这说明,单抗药物有可能用于克服肿瘤细胞抗药性。[b]五　　单克隆抗体靶向药物[/b]单抗靶向药物是利用单抗对肿瘤表面相关抗原或特定的受体特异性识别,从而把药物直接导向肿瘤细胞,提高药物的疗效,降低药物对循环系统及其他部位的毒性。研究表明,单抗靶向药物具有很好的疗效,在免疫偶联物对移植于裸鼠的相应人体肿瘤生长有抑制作用。免疫偶联物与相应的游离物比较,具有更高更好的疗效和较低的细胞毒性[sup][/sup]。单克隆抗体体积小,能更有效地透入肿瘤；分子小、消除快、累积毒性小；所携带的弹头脱离后,可较快被清除 循环中免疫靶向结合物对靶细胞的竞争作用小；半衰期短；穿透性好；能穿过血脑屏障[sup][/sup],因而还可以作为新一代靶向载体。与化学药物、毒素、放射性核素、生物因子、基因、分化诱导剂、光敏剂、酶等物质构成单克隆抗体靶向药物,把杀伤肿瘤细胞的活性物质特异的输送到肿瘤部位,利用单抗对肿瘤表面相关抗原或特定的受体特异性识别,从而把药物直接导向肿瘤细胞,提高药物疗效,降低药物对循环系统及其他部位的毒性。近年来,随着医学、药学和生物工程学及技术的进步,临床对肿瘤的根治和对癌细胞的攻击锁定于表皮生长因子和血管内皮生长因子等靶位,使药物治疗的切入点由细胞水平提升到分子和抗体水平,从而提高了肿瘤综合治疗的效果。[align=center]六　　人源化单克隆抗体[/align]单克隆抗体是近年竞相开发的品种,自1997年第1个单克隆抗体rituximab通过食品与药物管理局(FDA)批准应用于临床以来,目前已经上市的单克隆抗体靶向药物的疗效令人瞩目,在抗肿瘤、类风湿性关节炎和自身免疫系统缺陷治疗领域得到了有力的推广,其以独特的作用优势,在肿瘤的治疗中不但能够选择性杀伤癌细胞,且在体内表现出特异的分布特性,具有高效、低毒的特点,从而在生物技术产品领域中占据了1/3的市场[sup][/sup]。目前用于治疗肿瘤的单克隆抗体药已有多个,包括伊珠单抗奥加米星、帕尼单抗、曲妥珠单抗等。伊珠单抗奥加米星又名CMC-544，是以人源化抗CD22的抗体伊珠单抗与 CalichDMH偶联形成的ADC药物，用来治疗复发性或难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤（B cell-NHL）和急性淋巴细胞白血病（ALL），目前已经进入临床 III期试验[sup][/sup]。帕尼单抗是一种IgG2单克隆抗体完全人源化可以与EGFR高度特异性地结合，进而阻断配体诱导的信号激活，从而抑制肿瘤生长。有临床研究选择既往未治疗过的ⅢB或Ⅳ期非小细胞肺癌患者比较卡铂(AUC=6，每3周)，加紫杉醇(200mg/m21次/3周) 联合或不联合帕尼单抗(2.5 mg/m2，1次/周) 化疗的疗效及其安全性。研究结果显示，单纯化疗组与帕尼单抗联合化疗组之间在PFS(5.3个月对比4.2个月、P=0.55)和总生存( Overall survival，OS)(8.0个月对比8.5个月，P =0.81)上均无显著差异。结果提示帕尼单抗联合一线化疗方案可能对晚期非小细胞肺癌无明显疗效[sup][/sup]。曲妥珠单抗是一种抗Her2的单克隆抗体，他可以和肿瘤细胞的HER2/neu特异性地结合，从而阻断细胞内生长信号的转导，同时曲妥珠单抗还可以诱导体内巨噬细胞以及自然杀伤细胞攻击肿瘤细胞，以达到抑制和杀伤肿瘤细胞的目的。比较用或不用曲妥珠单抗联合一线化疗方案用以治疗ⅡB/Ⅲ期HER2/neu阳性的 NSCLC患者差异的两项大型的随机Ⅱ期临床试验，其结果显示两个试验结论相似，曲妥珠单抗不能提高化疗的疗效,但也不加重化疗的不良反应。试验中HER2/neu值为3+的患者对曲妥珠单抗治疗的反应性较好，提示曲妥珠单抗对这一较少见类型的NSCLC效果要更好[sup][/sup]。在临床治疗中使用鼠派生单抗的主要障碍之一是产生人抗鼠抗体(HAMA)反应,通过基因工程技术制备嵌合抗体的I-IPdVIA反应率较鼠源性单抗低,但完全的人源抗体才是单抗药物的发展目标。噬茵体抗体库技术和转基因小鼠技术是制备完全人源单抗的两种方法[sup][/sup]。因此,只有不断地完善单克隆抗体人源化的技术,才能更好地将完全人源化的单克隆抗体用于肿瘤分子靶向治疗中,从而使医学界迈向更高的台阶。[b]七　　问题与对策[/b]在限制单克隆抗体临床治疗效果的因素有:(l)循环免疫复合物导致的肝肾功能损害。(2)可溶性肿瘤抗原释放造成的体液中的封闭作用。(3)异种蛋白反应。(4)特异性还不够专一,引起了正常细胞的伤害。(5)天然免疫功能低下(如补体介异的细胞毒,网状内皮系统清除和ADCC作用等)。(6)主要的问题还在这种免疫疗法会导致靶细胞(肿瘤细胞)上抗原的转换。为了解决这些问题,今后的研究应着重:(1)制备对肿瘤抗原有高度特异性的单克隆抗体。(2)选择不易诱导抗原转换的单克隆抗体。(3)研究副作用较少,既安全疗效又高的偶联制剂。单抗（Mab）药物存在的一个最关键问题就是人抗鼠抗体反应（HAMA）。由于用于临床研究的Mab药物一般使用鼠源Mab,这不可避免地会引起HAMA反应,所以尽量避免HAMA反应这一副作用才是Mab药物能否真正适合治疗肿瘤性疾病的重点[sup][/sup]。近些年来,Mab药物的研究主要是向减轻宿主对外源抗体的排斥,促进抗体人源化,改变抗体的氨基酸序列而增加或降低该抗体的生物学效应,加抗体的亲和力,制备双特异性抗体,改造抗体重链恒定区以增强抗体功能,以及寻找新的分子靶点(相对特异的肿瘤抗原)等方向发展[sup][/sup]。Mab药物的不断更新,必将为全球的肿瘤患者带来更大的希望。[align=center]八　　总结与展望[/align]目前肿瘤治疗中使用最广泛的仍是化疗以及放射性疗法,其毒副作用较大。随着基因工程技术和DNA重组技术的兴起,利用单克隆抗体治疗肿瘤已经日渐取代副作用较大的传统疗法而成为新的发展趋向。所以,如何研制更多的单克隆抗体以及怎样更好的利用单克隆抗体治疗肿瘤,将成为肿瘤治疗研究中的又一艰巨任务。同时,生物技术以及抗肿瘤化学药物的发展也必将推动单抗药物的发展与进步,单克隆抗体药物将在各种肿瘤的治疗中发挥越来越重要的作用。在未来10年内,单克隆抗体药将成为国内、外生物药品发展的主旋律。此外，利用与肿瘤细胞相关抗原的特异结合力,相应的单克隆抗体可以用于肿瘤早期诊断和预后判定。例如用放射标记抗体能够确定肿瘤存在的位置,扩散的部位和范围,以便确定手术时机和化疗方案。通过测定抗体结合白血病细胞的增减,可以检查白血病的化疗效果[sup][/sup]。利用单克隆抗体检测某些癌的特异性产物,如前列腺癌产生的酸性磷酸酶,绒毛膜上皮癌产生的促性腺激素,结肠癌产生的癌胚抗原及肝癌产生的甲胎蛋白等,有助于癌肿的早期诊断[sup][/sup]。单克隆抗体在肿瘤的治疗中的作用功不可没，但同时也面临着巨大的挑战，例如如何选择优势人群、进一步提高疗效、降低不良反应的发生都是需要进一步解决的。如贝伐单抗的突出不良反应是出血，在NCCN指南中特别指出贝伐单抗仅适用非鳞癌的[sup][/sup]，既往无咯血史的患者，限制了贝伐单抗的临床应用。而其他大部分单克隆抗体均需与其他化疗药物联用，单独应用的疗效仍有限，选择合适的指标以及合适人群应用单克隆抗体仍任重而道远。[b]参考文献[/b] 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缺血性脑卒中是人类死亡的主要原因之一，也是全球范围内成人致残的主要原因[1]。2019年我国有缺血性脑卒中患者2 418万例，给我国医疗卫生系统造成巨大负担[2]。缺血后大脑血液供应的中断会引发一系列病理生理改变。尽管恢复脑血流对挽救缺血组织至关重要，但血流恢复可能会进一步加重脑损伤[3]。再灌注损伤的机制包括活性氧（reactive oxygen species，ROS）的突然产生、自噬的激活和细胞因子的释放，其中线粒体功能障碍在介导这些病理生理过程中发挥重要作用[4]。目前，重组组织纤溶酶原激活剂（recombinant tissue plasminogen activator，rt-PA）已被批准应用于缺血性脑卒中的治疗[5]。由于治疗时间窗窄，能够应用rt-PA治疗的患者不足10%[6]。因此，寻找更有效的防治缺血性脑卒中的药物至关重要。 在中医理论中，缺血性脑卒中属于“中风”范畴。补阳还五汤是治疗缺血性脑卒中的经典方剂，已有数百年的临床应用历史[7-8]。方中以生黄芪为君药，补益元气，旨在气旺则血行，瘀去则络通，对中风之气虚血瘀证有显著疗效。现代药理学研究证实，芒柄花素是黄芪的主要活性成分之一，具有抗炎[9]、抗氧化[10]、神经保护[11]等作用。但是，水溶性差限制了其在中枢神经系统的应用。通过磺化反应合成的芒柄花素磺酸钠（sodium formononetin-3?-sulphonate，Sul-F）克服了其水溶性差的难题，为其应用于缺血性脑卒中的研究提供了物质基础。 本研究通过建立大脑中动脉栓塞模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠模型，考察Sul-F对大鼠脑缺血再灌注（ischemia-reperfusion, I/R）损伤的改善作用和对线粒体凋亡通路的影响，旨在探讨Sul-F是否通过调控线粒体凋亡通路改善脑I/R损伤。 1 材料 1.1 动物 SPF级雄性SD大鼠75只，体质量（300±10）g，购自斯贝福（北京）有限公司，许可证号SYXK（冀）2021-006。大鼠饲养于动物房，温度（25±1）℃，相对湿度（50±10）%，昼夜周期为12 h，自由摄食饮水，实验开展前适应性饲养1周。本实验所有操作均严格按照动物伦理要求进行，且经河北中医学院实验动物管理和伦理委员会批准（批准号DWLL202306001）。 1.2 药品与试剂 依达拉奉注射液（国药准字H20080056，批号2109050）购自国瑞药业有限公司；Sul-F（质量分数＞95%，批号160901）由河北国金药业有限责任公司提供；2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染液（批号1222A23）购自美国Sigma-Aldrich公司；苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染液试剂盒（批号MD070823）购自碧云天生物技术有限公司；原位末端标记（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）检测试剂盒（批号061223240108）、线粒体膜电位（JC-1）检测试剂盒（批号C2006）购自碧云天生物技术有限公司；谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）测定试剂盒（批号A005-1）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测定试剂盒（批号A001-3）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）测定试剂盒（批号A003-1）均购自南京建成生物工程研究所；电镜固定液（批号02607-BA）、包埋剂（批号90529-77-4）、醋酸双氧铀（批号H60602624A8）购自SPI公司；无水乙醇（批号100092183）、丙酮（批号10000418）购自国药集团化学试剂有限公司；铜网（批号BZ100205a）购自北京中镜科仪技术有限公司；锇酸（批号18456）购自Ted Pella公司；柠檬酸铅（批号180705-C5382）购自EMS公司；β-actin抗体（批号86e1489）、B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗体（批号35y4418）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗体（批号43z8686）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）抗体（批号53j2158）购自Affinity公司；HRP标记的山羊抗兔二抗（批号20220521）购自北京百奥思科生物科技有限公司；Trizol（批号342430AX）购自艾德莱公司；ExonScript First-Strand Synthesis SuperMix with dsDNase试剂盒（批号231106-A5）购自成都市蓉为基因生物科技有限公司；硅胶线栓（批号230701162）购自长沙迈越生物科技有限公司。 1.3 仪器 JT-12J型全自动脱水机、JB-L5型加热石蜡包埋系统（武汉俊杰电子有限公司）；RM2235型石蜡切片机、UC7型超薄切片机（德国Leica公司）；XS-2100型光学显微镜（NOVEL公司）；ELCIPSE-CI型正置荧光显微镜（日本Nikon公司）；7800型透射电子显微镜（日本Hitachi公司）；LF-2000型SDS-PAGE电泳系统（北京龙方科技有限公司）；JYO2S型凝胶成像系统（北京君意东方电泳设备有限公司）；chemiscope 6100型化学发光成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司）；272005652型实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪（美国Life Techologies公司）；BeamCyte-1026型流式细胞仪（必达科生物科技有限公司）；680型酶标仪（美国Bio-Rad公司）。 2 方法 2.1 动物造模、分组及给药 大鼠I/R损伤模型的建立参照文献方法[12]，大鼠ip 1%戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉后，置于加热垫上，保持肛温37 ℃。颈前皮肤备毛，在前正中线做切口，暴露颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，结扎颈外动脉远端，夹闭颈内动脉远端颈总动脉近端，将线栓经颈内动脉送入大脑中动脉，推送线栓18～20 mm，缺血2 h后拔出线栓并且结扎端口。再灌注0 h时，选择神经功能评分为1～3分的大鼠，随机分为模型组、依达拉奉（3 mg/kg）[13]组和Sul-F高、低剂量（80、40 mg/kg）组，每组15只。另取15只大鼠仅分离血管不插线栓作为假手术组。分别于再灌注0、12 h尾iv给药（4 mL/kg），假手术组和模型组给予等体积的生理盐水。再灌注24 h后取材进行后续实验。 2.2 神经功能评分 再灌注0、24 h时，采用盲法对各组大鼠进行Zea-Longa评分[14]：0分，活动基本正常；1分，提起时对侧前爪无法完全伸展；2分，向手术对侧转圈；3分，向手术对侧倾倒；4分，意识丧失。 2.3 TTC染色测定脑梗死体积 大鼠麻醉，断头取脑，?20 ℃冷冻30 min，以1.5～2 mm厚度进行冠状面切片。置于TTC染液玻璃皿中，37 ℃避光孵育30 min，吸出多余的TTC染液，倒入4%多聚甲醛固定过夜，相机拍照后用Image J软件进行分析，记录脑梗死面积（灰白色）及全脑面积（红色），计算脑梗死体积率[15]。 脑梗死体积率＝(脑梗死面积×厚度)/(全脑面积×厚度) 2.4 HE染色观察脑组织病理变化 大鼠麻醉，断头取脑，4%多聚甲醛固定24 h，沉糖1周，石蜡包埋，以4 μm厚度行冠状切片，HE染色后于光学显微镜下进行观察与拍照。 2.5 TUNEL荧光染色观察脑组织细胞凋亡情况 将石蜡切片标本进行脱蜡、复水、抗原修复以及H2O2封闭，按照TUNEL凋亡检测试剂盒说明书进行TUNEL染色，并使用DAPI对细胞核进行复染。封片后置于荧光显微镜下观察与拍照，并计算细胞凋亡率。 细胞凋亡率＝TUNEL阳性细胞数/DAPI阳性细胞数 2.6 JC-1探针检测脑缺血半暗带组织线粒体膜电位情况 取脑缺血半暗带组织，经300目钢网研磨、滤过到60 mm培养皿中，将滤过后的组织悬液转入15 mL新离心管中。加入Hank平衡盐溶液稀释至10 mL，反复吹打30次，冰上静置5 min，取上清液至15 mL新离心管中。滤过2次，滤液经1 000 r/min离心10 min，弃上清，加入Hank平衡盐溶液重悬，离心后弃上清。加入1 mL Hank平衡盐溶液重悬，细胞计数板计数，并调整细胞密度为1×106个/mL。取200 μL细胞，重悬于0.5 mL细胞培养液中。按照试剂说明书进行染色，流式细胞仪上机检测，以红绿荧光的比值表示线粒体膜电位变化。 2.7 透射电镜观察脑缺血半暗带组织超微结构 取缺血半暗带脑组织，剪成1 mm3小块，经PBS漂洗、4 ℃固定（2.5%戊二醛，12 h）、PBS漂洗、固定（1%锇酸，2 h）、PBS漂洗、丙酮脱水（30%、50%、70%、80%、95%、100%）、渗透包埋（Epon812）、超薄切片、染色（醋酸双氧铀和柠檬酸铅）后，在透射电子显微镜下采集图像分析。 2.8 ELISA检测脑缺血半暗带组织匀浆中MDA水平和SOD、GSH-Px活性 取缺血半暗带脑组织匀浆，按照试剂盒说明书进行操作，采用酶标仪测量吸光度（A）值，并计算MDA水平和SOD、GSH-Px活性。 2.9 qRT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]检测脑缺血半暗带组织Caspase-3、Bcl-2和Bax mRNA表达 取缺血半暗带脑组织，Trizol法提取总RNA，紫外分光光度计测定总RNA浓度。利用逆转录试剂盒Superscript III将RNA反转录成cDNA，加入引物，以β-actin为内参，荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪扩增，采用2???Ct法计算缺血半暗带Caspase-3、Bcl-2和Bax mRNA表达水平。 图片 2.10 Western blotting检测脑缺血半暗带组织Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表达 取缺血半暗带脑组织，加入裂解液提取蛋白，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，于5%牛血清白蛋白中封闭，分别加入Caspase-3、Bcl-2、Bax抗体（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，洗膜后，加入二抗（1∶20 000），37 ℃孵育1 h。滴加ECL混合液反应4 min后，采用化学发光成像系统显影并对条带灰度值进行分析。 2.11 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行数据分析，正态分布计量资料以表示，非正态分布计量资料以M（P25～P75）表示。多组间均数比较，服从正态分布与方差齐者，采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD检验；不服从正态分布者，采用Kruskal-Wallis检验。 3 结果 3.1 Sul-F对MCAO大鼠神经功能评分的影响 如表2所示，与假手术组比较，模型组大鼠神经功能评分显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，依达拉奉组和Sul-F高剂量组大鼠神经功能评分均显著降低（P＜0.01），Sul-F低剂量组神经功能评分无显著变化；依达拉奉组与Sul-F高剂量组比较，神经功能评分无统计学差异。 图片 3.2 Sul-F对MCAO大鼠脑梗死体积的影响 如图1-A、B所示，与假手术组比较，模型组大鼠脑梗死体积率显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，依达拉奉组和Sul-F高剂量组大鼠的脑梗死体积率显著降低（P＜0.05）；依达拉奉组与Sul-F高剂量组比较差异无统计学意义。 图片 3.3 Sul-F对MCAO大鼠脑缺血半暗带病理损伤与细胞凋亡的影响 如图1-C所示，假手术组大鼠脑缺血半暗带神经细胞形态结构正常，结构致密，核仁清晰；模型组脑缺血半暗带神经细胞肿胀，空泡增多，细胞核大小不一，形态不规则，核固缩偏于细胞一侧，部分核溶解。与模型组比较，依达拉奉组与Sul-F高剂量组脑缺血半暗带组织病理损伤情况明显改善，Sul-F低剂量组脑缺血半暗带组织病理损伤情况无明显改善。 如图1-D、E所示，与假手术组比较，模型组脑缺血半暗带TUNEL阳性细胞数显著增多（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组TUNEL阳性细胞数显著降低（P＜0.01）；依达拉奉组与Sul-F高剂量组比较，TUNEL阳性细胞数无统计学差异。 3.4 Sul-F对MCAO大鼠脑缺血半暗带线粒体膜电位变化的影响 如图2所示，与假手术组比较，模型组大鼠脑缺血半暗带线粒体膜电位显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，依达拉奉组和Sul-F高剂量组线粒体膜电位显著升高（P＜0.05），两组之间比较无明显差异。 图片 3.5 Sul-F对MCAO大鼠脑组织超微结构的影响 如图3所示，假手术组大鼠脑组织线粒体丰富，分布均匀，线粒体嵴清晰可见，未见明显损伤的线粒体，无典型的线粒体自噬结构。模型组线粒体总体数量减少，线粒体嵴不清晰、水肿，可见典型自噬小体形成。与模型组比较，依达拉奉组线粒体数量增多，大部分线粒体嵴清晰，偶见线粒体自噬结构；Sul-F低剂量组线粒体数量增多，一部分线粒体嵴清晰，另一部分线粒体水肿，可见典型自噬小体形成；Sul-F高剂量组线粒体数量增多，大部分线粒体嵴清晰，偶见线粒体自噬结构。 图片 3.6 Sul-F对MCAO大鼠脑缺血半暗带组织氧化应激水平的影响 如图4所示，与假手术组比较，模型组大鼠脑缺血半暗带区组织MDA水平显著升高（P＜0.01），SOD和GSH-Px活性显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组MDA水平显著降低（P＜0.05、0.01），SOD活性显著升高（P＜0.01）；Sul-F高剂量组GSH-Px活性显著升高（P＜0.01）。 图片 3.7 Sul-F对MCAO大鼠脑缺血半暗带组织Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA和蛋白表达的影响 如图5所示，与假手术组比较，模型组大鼠缺血半暗带区Caspase-3和Bax mRNA表达水平显著升高（P＜0.01），Bcl-2 mRNA表达水平显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠缺血半暗带区Caspase-3和Bax mRNA表达水平显著降低（P＜0.01），Bcl-2 mRNA表达水平显著升高（P＜0.01）；与依达拉奉组比较，Sul-F高剂量组大鼠缺血半暗带区Caspase-3、Bax和Bcl-2 mRNA表达水平无显著差异。 图片 如图6所示，与假手术组比较，模型组大鼠缺血半暗带区Caspase-3和Bax蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），Bcl-2蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠缺血半暗带区Caspase-3和Bax蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），Bcl-2蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）；与依达拉奉组比较，Sul-F高剂量组大鼠缺血半暗带区Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达水平无显著差异。 图片 4 讨论 缺血性脑卒中占所有脑卒中的80%～85%，具有较高的致死率和致残率[16]。目前，缺血性脑卒中的治疗手段有机械取栓和药物溶栓，以尽快恢复脑血流、挽救缺血脑组织，但复流复氧可能加重脑组织损伤[3,17]。脑I/R损伤会引发一系列的病理反应，如离子失衡、细胞膜通透性改变、能量代谢障碍等，最终触发凋亡程序，引发细胞凋亡。细胞凋亡涉及线粒体通路和死亡受体通路，其中线粒体通路是启动凋亡程序的关键。因此，改善线粒体功能、保护神经元是治疗脑I/R损伤的关键。 正常情况下，线粒体产生的自由基及其清除处于动态平衡，在缺血等应激条件下，ROS生成过多，氧化还原平衡受损线粒体膜脂质过氧化和结构破坏，造成线粒体功能紊乱和氧化应激损伤[17]。SOD与GSH-Px是机体抗氧化酶系统的重要物质，通过清除线粒体ROS来减轻氧化应激损伤。线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）是由三羧酸循环产生的能量传递给电子并经呼吸链传递过程中，将质子从线粒体内膜的基质侧泵到内膜外所形成的跨膜电位差，MMP的下降是线粒体氧化应激损伤的早期指标[18]。本研究显示，在脑I/R损伤时，脑组织线粒体受损，主要表现有线粒体肿胀变形、线粒体嵴结构不清，可见线粒体自噬小体。同时，线粒体膜电位显著下降，氧化应激反应被激活，MDA含量显著升高，SOD和GSH-Px活力显著降低。 线粒体途径作为细胞凋亡的关键途径，主要受到Bcl-2家族和Caspase家族相关基因的调控。线粒体功能受损产生大量ROS，ROS过度累积会触发线粒体膜通透性转换孔打开，线粒体膜电位下降[19]。Bcl-2家族蛋白通过调节线粒体外膜通透性在细胞内凋亡信号转导中发挥重要作用。Bax和Bcl-2是Bcl-2家族的主要成员，二者通常以异源二聚体的形式存在。MMP升高时，Bcl-2表达上调，抑制细胞色素C释放以维持线粒体平衡，当Bax高表达时，MMP降低，线粒体中的细胞色素C释放入胞质中，在三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）和dATP的协助下生成凋亡复合物，招募并启动Caspase-9，Caspase-9解体形成cleaved Caspase-9并进一步启动Caspase-3，激活下游Caspase级联瀑布，启动线粒体介导的细胞凋亡[20-21]。Caspase-3是Caspase家族中参与细胞凋亡的关键酶，可导致线粒体膜通透性增加、DNA断裂和染色质浓缩，可能是缺血性神经元核降解的关键执行者[17]。本研究中，脑I/R损伤使促凋亡基因Bax表达显著上调，抑凋亡基因Bcl-2表达显著下调，Caspase-3表达显著上调，提示脑I/R损伤时，线粒体介导的细胞凋亡途径启动。 芒柄花素是经典名方补阳还五汤君药黄芪的活性成分之一。体外研究发现，芒柄花素能够抑制多腺苷二磷酸核糖聚合酶1/凋亡诱导因子/蛋白激酶B（poly-adenosine diphosphate ribose polymerase/ apoptosis inducing factor/protein kinase B，PARP1/ AIF/Akt）信号通路减轻糖氧剥夺/复氧复糖条件下HT22小鼠神经元细胞损伤[22]。为提高其水溶性和生物利用度，经磺化反应合成芒柄花素磺酸钠。前期研究证实，Sul-F能够通过血脑屏障、低毒[23-25]。本研究发现，Sul-F能够减低脑I/R损伤大鼠的神经功能评分、降低脑梗死体积、减轻脑缺血半暗带的病理损伤及细胞凋亡，进而改善脑I/R损伤。 线粒体功能障碍是脑缺血再灌注诱导神经元死亡的标志之一[26]，因此机制研究旨在探讨Sul-F对线粒体介导的细胞凋亡途径的影响。结果显示，Sul-F能够降低脑组织氧化应激水平，部分逆转线粒体膜电位的降低，改善线粒体超微结构损伤，调节Bcl-2/Bax平衡，降低Caspase-3表达，进而抑制线粒体凋亡途径，降低细胞凋亡，对脑I/R损伤具有潜在的治疗价值。 本研究以大鼠大脑中动脉栓塞模型模拟脑I/R损伤，结果显示Sul-F干预能够降低脑组织氧化应激水平，部分逆转线粒体膜电位的降低，改善线粒体超微结构损伤，降低细胞凋亡，改善脑梗死体积和神经功能评分。进一步研究发现，Sul-F能够降低Bax表达、升高Bcl-2表达，降低下游Caspase-3表达，抑制线粒体凋亡信号通路。综上，Sul-F通过调控Bcl-2/Bax平衡，降低线粒体介导的细胞凋亡，改善脑缺血再灌注损伤。