【转帖】薄层层析-紫外分光光度法测定香丹注射液中原儿茶醛的含量

香丹注射液为棕色澄明液体，是由降香和丹参提取物配制而成，临床用于治疗心绞痛、心肌梗死等。处方中降香是豆科植物降香檀树干和根的干燥心材，性辛，温，能活血止血，行气止痛。丹参为唇形科植物丹参的干燥根及根茎，性微寒味苦，具有活血化瘀，凉血消肿，清心除烦之功效。丹参的化学成分［1］为两类，一类为脂溶性的二萜醌类，主要为丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡＡ，具有抗菌、抗炎及扩张血管作用；另一类为水溶性的酚酸类，主要为原儿茶醛，是抗心绞痛有效成分。中华人民共和国药品卫生部药品标准WS3-B-3289-98采用高效液相色谱法测定香丹注射液中原儿茶醛的含量［2］。本文参考有关文献［3，4］建立了薄层层析-紫外分光光度法分离测定香丹注射液中原儿茶醛的含量，方法简便，准确度高，精密度好，成本低廉。
1 材料与仪器
1.1 材料 二氯甲烷、乙酸乙酯、甲酸，均为分析纯。对照品：原儿茶醛（中国药品生物制品检定所）。薄层层析硅胶G（青岛海洋化工有限公司）化学纯。水为蒸馏水。香丹注射液（10ml/支）。
1.2 仪器 752紫外可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）。微量点样器（5μl）。分析天平。
2 实验方法
2.1 薄层层析条件的考察
2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取原儿茶醛对照品1.1mg，置10ml容量瓶中，加水溶解稀释至刻度，摇匀即得浓度为0.11mg/ml。
2.1.2 阴性对照品溶液的制备 取降香10g加水100ml浸润，进行水蒸汽蒸馏，收集蒸馏液约5ml，冷藏静置24h，分去油层，收集水溶液得到阴性对照品溶液。
2.1.3 展开条件的选择 薄层板为0.3%CMC-Na的硅胶G板，105℃活化0.5h，置干燥器中备用。精密吸取香丹注射液10μl点于硅胶G-CMCNa薄层板上，另取原儿茶醛对照品溶液和阴性对照品溶液分别点于香丹注射液斑点两侧。以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（8∶5∶0.8）为展开剂，展开约12cm。取出，晾干，浓氨水显色，结果见图1。
2.2 含量测定方法的建立
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取原儿茶醛对照品1.1mg，置10ml容量瓶中，加水溶解稀释至刻度，摇匀即得浓度为0.11mg/ml。
2.2.2 供试品溶液的制备 精密吸取香丹注射液20μl，点于硅胶G-CMCNa(0.3%)薄层板上，另取对照品溶液10μl点于供试品斑点一侧作为对照。以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（8∶5∶0.8）为展开剂，展开约12cm，取出，晾干。在紫外灯(365nm)下观察，定位。刮取与对照品斑点相应位置上的供试品斑点，精密加入5ml水溶解，过滤，即得原儿茶醛供试品溶液。
2.2.3 检测条件的选择 文献记录原儿茶醛在281nm处吸光度最大。精密量取对照品溶液1ml置10ml的容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。以蒸馏水为空白对照在281nm左右测定吸光度，结果281nm处吸光度大。 1 为对照品溶液；2 为香丹注射液；3 为阴性对照品溶液图1 香丹注射液薄层层析图
2.2.4 标准曲线的制备 精密量取对照品溶液5ml置10ml的容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。分别精密量取0.1ml，0.3ml，0.5ml，0.7ml，0.9ml对照品溶液置10ml的容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。使浓度分别为0.55μg/ml，1.65μg/ml，2.75μg/ml，3.85μg/ml，4.95μg/ml。 以蒸馏水为空白对照在281nm波长处测吸光度，以吸光度（A）为纵坐标，浓度（C）为横坐标，进行回归分析，回归方程为：A=2.6×10-3+0.1015C，r=0.9998（n=5）。 结果表明，原儿茶醛在浓度0.55～4.95μg/ml 范围内线性关系良好。测定结果见表1。表1 标准曲线的制备
2.2.5 稳定性试验 精密吸取香丹注射液20μl，点于硅胶G-CMCNa(0.3%)薄层板上，另取对照品溶液10μl点于供试品斑点一侧作为对照。以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（8∶5∶0.8）为展开剂，展开约12cm，取出，晾干。在紫外灯(365nm)下观察，定位。刮取与对照品斑点相应位置上的供试品斑点，精密加入5ml水溶解，过滤，即得原儿茶醛供试品溶液。刮取同一薄层板上与供试品斑点等面积的空白硅胶G-CMCNa(0.3%)，精密加入5ml水溶解，过滤，取滤液作为空白对照。 取供试品溶液和对照品溶液分别在281nm波长处测吸光度，隔30min测定一次，连续测定3h，结果在3h内吸收度稳定。测定结果见表2。
2.2.6 精密度试验 取同一供试液连续测定6次，结果表明精密度良好。测定结果见表3。 表2 稳定性试验结果表3 精密度试验结果
2.2.7 含量测定 分别精密吸取香丹注射液20μl两份，点于硅胶G-CMCNa(0.3%)薄层板上，另取对照品溶液10μl点于供试品斑点一侧作为对照。以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（8∶5∶0.8）为展开剂，展开约12cm，取出，晾干。在紫外灯(365nm)下观察，定位。刮取与对照品斑点相应位置上的供试品斑点，精密加入5ml水溶解，过滤，即得原儿茶醛供试品溶液Ⅰ和Ⅱ。 刮取同一薄层板上与供试品斑点等面积的空白硅胶G-CMCNa(0.3%)，精密加入5ml水溶解，过滤，取滤液作为空白对照。 取样品在281nm波长处测吸光度，由标准曲线计算供试品中原儿茶醛的含量。测定结果见表4。表4 含量测定结果注：吸光度为供试品溶液Ⅰ和Ⅱ的平均值
2.2.8 加样回收率试验 精密吸取香丹注射液5ml，置于10ml量瓶中，分别加入对照品1.0mg、1.5mg、2.1mg，加水至刻度，摇匀，按“含量测定”项下操作，测定，计算回收率，结果见表5。表5 加样回收率试验结果

3 实验结果
原儿茶醛在0.55～4.95μg/ml 范围内线性关系良好，r=0.9998。平均含量为0.174mg/ml，加样回收率为97.3%～102.3%，RSD为1.61%。
4 讨论
(1)点样斑点直径应控制在2～3mm，有较好的分离效果。
(2)原儿茶醛为丹参水溶性酚酸类成分，在展开剂中加入少量甲酸，抑制酸的解离。文献中使用的展开剂为苯-乙酸乙酯-甲酸（8：5：0.8），但是苯有毒性，本实验用与苯有相似极性二氯甲烷代替亦得到了较好的分离效果。
(3)本实验过程中还使用过甲醇-水-冰醋酸（22：78：0.5），氯仿-甲醇-水（8：1：1）。但分离效果都不好，采用二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（8：5：0.8）作为展开剂有较好分离效果。
(4)降香挥发油水饱和溶液在本实验条件下不干扰原儿茶醛的含量测定。
5 结论
实验结果表明，薄层层析-紫外分光光度法测定香丹注射液中原儿茶醛的含量，方法操作简便，准确度高，精密度好，可作为样品的检测方法。
【参考文献】
1 刘燕，谢培德，王宝琴.丹参及其制剂质量的评价方法.中国中药杂志，1990，15（3）：31-34.
2 中华人民共和国药品卫生部药品标准WS3-B-3289-98.
3 蔡梅，季一兵，骆雪芳，等.高效液相色谱法测定香丹注射液中丹参素和原儿茶醛的含量.海峡药学，2004，16（3）：54-55.
4 王振鲁，于立佐.薄层-紫外分光光度法测定复方丹参膏中原儿茶醛的含量.山东医药工业，1999，18(6)：7-8. 信息来源：中国论文下载中心