一道黑
第1楼2008/11/28
7. 仪器设备
7.1 托盘天平
7.2 分析天平
7.3 磁力搅拌器
7.4 脱气装置
7.5 电冰箱+4℃
7.6 通风橱
7.7 试管,10mL,圆底具磨口塞
7.8 圆底烧瓶,150mL
7.9 聚乙烯瓶,125mL,广口
7.10 刻度玻璃吸管,10mL和25mL
7.11 量筒,250mL和1L
7.12 10mL和100mL容量瓶
7.13 巴斯德吸管
7.14 色谱用微型小瓶200μL
7.15 水泵
7.16 Millipore R060反渗透和milli Q 去离子水系统
7.17 均质器
7.18 离心机
7.19 过滤装置,布氏漏斗
7.20 色谱用滤纸(7.0cm)
7.21 超声水浴器
7.22 HPLC系统
7.22.1 Waters 型501泵
7.22.2 Waters Model 455LC 分光光度计,波长:450nm
7.22.3 色谱微处理机
7.22.4 Whatman Paticil 50DS-3色谱柱:25cm×4.6mm内径
7.22.5 自动进样器,配有50μL进样针
7.22.6 柱后衍生化反应器:特氟隆管(10ft×0.023ins i.d),死体积T-piece 混合室。
8 样品和取样程序
有关要求见ISO文件78/2-1982 6.3.1节,下列注释引自2052/VI/84EN附录Ⅱ和EEC 93/256。
8.1 样品的性状:样品应符合64/433/EEC指令中测定肉品中药物残留的要求。如无此类样品,生物体液或粪便可组成测定残留的样品。
8.2 样品量:样品量应满足测定方法及复验所需量的要求。
8.3 样品的保存和包装必须达到在实验室中正确辨识的要求。
8.4 样品的包装、贮存以及运输必须保持样品的完整性,并且不对检验结果造成任何偏差。检验磺胺二甲嘧啶的样品必须存放在-18℃以下。
9. 测定步骤
9.1 所有样品单独制备
9.2 称取5g±0.02g 新鲜组织于125mL聚乙烯瓶(17.9)中。
9.3 用3×5g阴性结果的样品制备控制样品,如下添加:
a.不加任何物质
b.100μL中间标准溶液Ⅱ(6.3.1.2)
c.200μL中间标准溶液Ⅱ(6.3.1.2)
9.4 于所有样品加入50mL氯仿-丙酮混合液(1+1)(6.2.7)。
9.5 加盖,然后高速均质约1min。
9.6 用水泵进行抽滤。
9.7 再加入10mL氯仿-丙酮混合液冲洗,并如9.6所示进行抽滤。
9.8 合并滤液并转移至100mL梨型瓶中,用旋转蒸发器于30℃去除溶剂。
9.9 加入2mL 50%甲醇的2%醋酸溶液和6mL正已烷溶解残渣。轻轻地旋动溶解,分配脂肪到正已烷层中。勿振动,否则将产生乳浊液。
9.10 将样液转移到10mL试管中(7.7),于2000rpm离心10min,弃去上层,移取200μL底层水溶液于HPLC小瓶中(7.14)供HPLC分析。
9.11 HPLC
9.11.1 紫外检测器波长为450nm(7.22.2)。
9.11.2 色谱柱温:室温。
9.11.3 流动相(6.2.5)流速为1mL/min,运行30min。以0.5mL/min流速引入柱后衍生化试剂,再运行30min。
9.11.4 进样50μL预先制备的标准工作液(6.3.1.3)校准系统,直至获得110±10mm峰高。
9.11.5 对每一个提取样液(9.9)进样50μL,每进4个样品后交叉运行一次1μg/mL的标准工作液(6.3.1.3),每个样品约运行10min,磺胺二甲嘧啶的保留时间是8min。
9.11.6 如果在样品中发现与标准物质色谱峰的保留时间相似的色谱峰,则混合等体系的标准溶液和样品溶液,重新进样分离。以检查色谱峰流出的重叠情况。
9.10.7 分析测试完毕后,用80%(V/V)甲醇-水,以0.5mL/min的流速通过系统过夜。当不使用时,在柱内应注入80%甲醇-水。
10 结果计算
用下式计算样品中磺胺二甲嘧啶的含量:
S(h) × C(Std)
C(s) = ——————————
Std(h)
式中: C(s) —— 样品中磺胺二甲嘧啶的含量,mg/kg
S(h) —— 样品的峰高
Std(h) —— 标准品的峰高
C(std) —— 磺胺二甲嘧啶标准溶液的浓度,在该提取液中,1mg/L的标准工作液
相当于0.4mg/kg (C(std))
10.1 确证数据
10.1.1 肝
阴性空白样品,被添加0,0.2,0.4mg/kg 的磺胺二甲嘧啶,在连续的三天内进行分析,其回收率为:
天 肾
(0.2mg/kg)
平均 SD CV 肾
(0.4mg/kg)
平均 SD CV 肌肉
(0.2mg/kg)
平均 SD CV 肌肉
(0.4mg/kg)
平均 SD CV
1
2
3 76 ± 6.7 8.8
79 ± 8.7 10.9
84 ± 8.1 9.7 84 ± 6.0 7.2
84 ±10.8 12.7
83 ± 6.4 7.7 86 ± 3.3 3.9
82 ± 7.8 9.5
77 ± 3.9 5.1 83 ± 4.5 5.4
77 ± 2.9 3.7
76 ± 3.9 5.1
总计 80 ± 7.8 9.8 84 ± 7.7 9.2 82 ± 5.0 6.2 79 ± 3.8 4.7
11. 特殊事例
12. 方法注意点
其它磺胺类药物在该HPLC条件下的保留时间为:
成分 保留时间
磺胺二甲嘧啶 8.4
磺胺胍 4.1
磺胺 4.2
磺胺噻唑 5.9
磺胺嘧啶 6.0
磺胺吡啶 6.2
磺胺甲基异恶唑 10.5
磺胺邻三甲氧嘧啶 12.0
磺胺间二甲氧嘧啶 23.8
磺胺喹恶琳 29.3
13.质量控制
猪组织标准物质的制备和确证工作已处于最后阶段,并由VRL,Belfast 实验室制备。
14. 检测报告
15. 缩写语(略)
见手册中12节附录1中缩写
16.检验流程图
组织样品 → 均质 → 溶剂提取 → 分配 → HPTLC → 计算结果