一道黑
第1楼2008/11/28
7. 仪器设备
7.1 分析天平
7.2 天平
7.3 振动混匀器
7.4 Stomacher 400(Labblender)
7.5 超声水浴(Bransonic 32)
7.6 离心机
7.7 玻璃棉或滤纸(S&S 595 1/2 φ15cm)
7.8 Sep-Pak硅胶处理柱(Waters - 51900)
7.9 对Sep-Pak小柱的抽取系统
7.10 具有氮气挥发系统的加热装置
7.11 HPTLC板:10×10cm,Kieselgel 60无荧光指示剂(Merck - 5631)
7.12 .微量吸管:5mL
7.13 TLC层析槽:10×10cm平板
7.14 厨房用搅拌器(Moulinette or Waring)
7.15 注射器:50mL,2mL
7.16 其它标准器皿
7.17 透照仪(UV)366nm
7.18 pH试纸:pH 5-9
7.19 pH计
7.20 Stomacher bags 1L
7.21 Camay Unispray kit (Camag)
7.22 黄-绿荧光斑点,摄显影装置,推荐的显影用滤光片是Wratten No 2E,Kodak CC10M和Wratten 1A 。在f8和600plus偏振片下曝光22.5秒。
8. 样品和取样程序
有关要求见ISO文件78/2-1982 6.3.1节,下列注释引自2052/VI/84EN附录Ⅱ。
8.1 样品的性状:样品应符合64/433/EEC指令中测定肉品中药物残留的要求。
8.2 样品量:样品量应满足测定方法及复验所需量的要求。
8.3 样品的保存和包装必须达到在实验室中正确辨识的要求。
8.4 样品的包装、贮存以及运输必须保持样品的完整性,并且不对检验结果造成任何偏差。检验磺胺类药物的样品必须存放在-18℃以下。
9. 测定步骤
9.1 质量控制:将已知未用磺胺类和氨苯砜处理和污染的动物肉均质后作为空白样品和阳性控制样品,并存放于-20℃直到分析之日。对于阳性控制样品加入相当于10μg/kg的磺胺类或氨苯砜于空白肉中,放置15分钟后再进行混匀。
9.2 试验用肉样品经混匀后在-20℃存放直到分析之日。
9.3 预提取
家禽肉(鸡)
9.3.1 称取10g均质后的肉,作为9.1和9.2的样品,然后用25mL二氯甲烷在Stomacker 中混合,用Stomacher提出取2分钟,通过玻璃棉过滤到100mL烧杯中,再重复提取两次,进入9.4步骤。
9.3.2 家畜和猪肉
称取10g均质肉作为9.1和9.2的样品,然后与25mL二氯甲烷在烧杯中混合,放入超声水浴中10分钟,温度不得超过40℃,通过玻璃棉过滤到100mL烧杯中,再重复提取二次。
9.4 在合并的二氯甲烷提取液中加入25mL石油醚。
9.5 Sep-Pak柱净化
9.5.1 取50mL接收器皿与Sep-Pak小柱相联结(7.8)。
9.5.2 将全部预提液(9.4)放入柱子。用5mL二氯甲烷冲洗烧杯,并转移该溶液到柱子中(注:50mL体积用轻微的抽吸,使其在大约15分钟通过柱子)。
9.5.3 用5ml pH 10磷酸盐缓冲液(6.2.2)洗脱磺胺类药物,收集第一个3mL于刻度试管中。
9.5.6 用pH试纸(7.18)控制pH,用磷酸(6.2.5)或用氢氧化钠(6.2.1)调节pH到6.5至7)。
9.6 用1mL乙酸乙酯在振动混合器上,振动30秒提取洗脱液(9.5.4),用台式离心机分层。转移0.5mL乙酸乙酯层于4mL小瓶中,在氮气流下挥发至干,加入50ul乙酸乙酯用旋涡混合器溶解残渣。
9.7 HPTLC
9.7.1. 用9.7.1.1中方案,吸取10ul样品提取液于层析板底部1.5cm处,斑点间隔约0.75-1cm距离,用氮气流控制溶剂在板上的挥发。滴放质量控制提取物,标准物质和参照样品如9.7.1.1所述。
9.7.1.1 在层析板的底部边缘1.5cm,从左至右排列斑点。
1.标准溶液 2.空白样品 3.加标样品 4.试验样品1 5.试验样品2
6.试验样品3 7.标准溶液 8.试验样品4 9.试验样品5 10.试验样品6
11.参考标准 12.标准溶液
9.7.2 放入溶剂(6.2.3)于层析糟中,深度为0.5cm,让其平衡30分钟。
9.7.3 将层析板放入溶剂中,让该溶剂体系运行4cm。
9.7.4 移出层析糟,然后用铅笔标记溶剂前沿位置。
9.7.5 在通风橱中干燥层析板20min,用荧光胺溶液(6.2.4)喷雾于层析板。5分钟后在366nm紫外灯下,观察层析板。
9.7.6 可以看到具有特征的黄绿色的磺胺类药物斑点。
9.7.7 如果确认是阳性,用铅笔或者用摄影器材(参见7.22)记录斑点。
10. 结果的解释
10.1 感兴趣的磺胺类药物和氨苯砜的Rf值是:(数据来自RIKIT-DLO,NL)。
成分 Rf
磺胺 0.33
磺胺噻唑 0.39
单乙酰基氨苯砜 0.43
磺胺嘧啶 0.57
氨苯砜 0.60
磺胺二甲嘧啶 0.64
Sulphachlorpyrazine 0.69
Sulphaquinoxaline 0.70
磺胺二甲氧嘧啶 0.78
磺胺强力霉素 0.80
10.2 磺胺斑点可看见明显的黄绿色。
10.3 加标空白样品分析必须被检测。
10.4 稳定的斑点如果暴露于光线下或者在暗处放置2小时以内,将非常快的消失。层析板应在喷撒荧光胺30分钟 以内进行观察。
10.5 氨苯砜的确认:如果它的代谢产物单乙酰基氨苯砜在层板板中也被检测到,便证实氨苯砜的存在。
11. 特殊事例
12. 方法注意点
荧光斑点在日光下不稳定
13.质量控制
14. 检测报告
15. 缩写语(略)
见手册中12节附录1中缩写
16.检验流程图
均质肉样 → 用二氯甲烷提取 → C18 Sep-Pak → HPTLC → 在UV灯下确认 →用荧光胺喷雾