【分享】欧盟兽药检测方法（之二十一）

7. 仪器
7.1.离心机
7.2.塑料离心管,容量为50mL,100mL.
7.3.超声波池.L&R 140S.
7.4.具塞的玻璃瓶,容量为2mL.
7.5.具塞的HPLC用玻璃瓶,容量为0.3mL.
7.6.玻璃瓶支架47mm.(Millipore UK Ltd).
7.7.均质器(Ultra-Turrax 或等同的).
7.8.测试管 125mm×16mm(适合30个真空歧管的速率).
7.9.一次性注射器,容量为1mL.
7.10.氮气流浓缩装置.
7.11.快速混匀器.
7.12.磁力搅拌器.
7.13.一次性注射器滤器,Cameo 3N,0.45μm,3mm(Jones Chromatography).
7.14.过滤膜,0.45μm“Durapore”,47mm.
7.15.冰箱,控温+4℃.
7.16.移液管,0.2mL,1.0mL,5.0mL(Gilson Pipetman).
7.17. 层析柱
7.17.1.Bond-Elut 接头.
7.17.2.Bond-Elut SCX 树脂柱,500mg/2.8mL(Jonees Chromatography).
7.17.3.Bond-Elut 储液器，75mL.
7.17.4.30只真空歧管(Applied Separations).
7.17.5.SCX层析柱准备:临用前用5mL1%的醋酸乙醇(6.3.1)洗柱(7.17.2).
7.25.HPLC
泵:Gilson 307
进样阀:Gilson model 231,20μL.
检测器:Philips Scientific PU4027荧光检测器,激发波长278nm,发射波长445nm.
色谱柱:250mm×4.6mm,Zorbax RX-C8,柱温35℃.流动相流速为0.5mL/min.
8.样品及取样程序
有关要求引自ISO文件78/2-1982 6.3.1节及2052/VI/84-EN附录II.
8.1.样品形状. 样品必须符合64/433/EEC指令所限定的肉类的残留检测的要求.
8.2.样品量. 样品必须具有检测及重复检测的数量.
8.3.样品的抽取及包装必须有适当的方式,以保证实验室能正确辨识.
8.4.样品的包装.储存及运输必须保持样品的完整性,以防止对测试结果造成偏差.
分析环丙氟派酸和英氟沙星的样品必须在-18℃以下储存及运输.
9.0 测定步骤
9.1样品的制备
一批处理样品最多8个.其中必须有一个阳性控制样品及添加检测限浓度的样品.
9.1.1. 将2g解冻样品切成薄片并放入50mL的离心管中.
9.1.2. 加入20mL1%醋酸乙醇溶液(6.3.1),均质1min,后放入超声波池中超声3min.
9.1.3 离心,4500rpm,5min.
9.1.4 将上清液小心地倒入100mL的塑料离心管中.
9.1.5 离心残渣用20mL1%醋酸乙醇(6.3.1)再提取一次.
9.1.6 合并上清液离心,转速4500rpm,5min.
9.2 过柱净化
9.2.1 将澄清的上清液通过已备好的Bond-Elut SCX柱(7.17.5),流速不能超过5mL/min.
注意:在操作的每一步中,柱内溶液不能流干.
9.2.2 先后用5mL甲醇（6.1.6）mL水，5mL甲醇洗柱.
9.2.3 用5mL25%氨水甲醇溶液(6.3.2)洗脱环丙氟派酸和英氟沙星至测试管中(7.8).
测试管置于氮气流浓缩装置上,将溶液蒸发至干.蒸发至1-2mL时,可加入乙腈加速蒸发.
9.2.4 在残渣中加入1mL的HPLC流动相(6.3.4),通过快速混匀器和超声波溶解3min.
9.2.5 将上述提取物转移到玻璃管（7.4）中,离心,4500rpm,5min.
9.2.6 将上清液转移至1mL可调注射器中,通过注射器滤膜
Cameo 3N 0.45um(7.13)过滤至HPLC玻璃管中(7.5).
9.3 HPLC测定
9.3.1. 按7.25所设定的条件,用自动进样器注入20μL样液于柱中.
9.3.2. 浓度为4ng/mL(相当于2ug/kg的组织浓度),20ng/mL(相当于10ug/kg的组织浓度),标准溶液分别测定三次,求环丙氟派酸和英氟沙星的平均峰高.
9.3.3. 环丙氟派酸和英氟沙星的峰应当避免背景噪音的干扰.
9.3.4. 检测器对环丙氟派酸和英氟沙星响应的线性由校准曲线确定.
10.0 计算结果
10.1. 样品中的环丙氟派酸和英氟沙星的含量通过校正曲线内插法峰面积定量.如果结果可疑，可对可疑阳性样品添加较大浓度标准溶液进行检测.如果复验结果只出一个大的峰，说明筛选检验结果确定的是阳性的.
10.2. 筛选方法. 每次进20μL的环丙氟派酸和英氟沙星的标准工作液测定三次,求出平均峰高(见9.3.2).
计算公式:
样品峰高/标准峰高 ×2.0×标准溶液浓度(组织浓度μg/kg).
10.3. 注意:一般情况下阳性样品是很少的,一旦发现,需进一步确认.
阳性样品经重复双实验再次检测,通过标准曲线定量.标准曲线至少有五个点,每个点测定三次,标准曲线按0到高出可疑样品浓度10%的范围绘制.重复实验时,空白加入与可疑样品相同的环丙氟派酸和英氟沙星浓度同时操作.
10.4. 方法采用前,应先对方法的重复性和再现性进行验证.
一批处理的8个样品(其中包括1个空白样和1个空白添加样品),以1mL添加溶液(6.2.7)添加至组织样品中相当于0.002mg/kg和0.01mg/kg，在每个水平上分三天测定三次.回收率应在45-110%范围内.变异系数应小于15%.
FSD,Norwich结果报告
CPX代表环丙氟派酸, EFX代表英氟沙星

牛肉添加实验
不同添加水平测试结果：
添加水平0.001mg/kg:80.9%±12.4%(CPX),82.4%±7.5%(EFX);添加水平0.01mg/kg:73.1%±2.1%(CPX),88.0%±4.0%(EFX);添加水平0.05mg/kg:
77.7%±2.5%(CPX),90.2%±6.6%(EFX).
同一水平三天测试结果:
添加水平0.01mg/kg:74.9%±6.9%(CPX),90.4%±5.6(EFX).

猪肉添加实验
不同添加水平测试结果：
添加水平0.002mg/kg:52.8%±1.3%(CPX),67.3%±4.9%(EFX);添加水平0.01mg/kg:51.3%±3.5%(CPX),75.6%±5.5%(EFX).
同一水平三天测试结果
添加水平为0.01mg/kg:53.9%±4.4%(CPX),74.8%±4.4%(EFX).

猪熏肉添加实验
不同添加水平测试结果：
添加水平0.002mg/kg:65.0%±3.9%(CPX),85.0%±
4.1%(EFX),添加水平0.01mg/kg:63.2%±1.6%(CPX),79.0%±1.1%(EFX).
同一水平三天测试结果
添加水平为0.01mg/kg:63.2%±4.7%(CPX),81.2%±5.9%(EFX).
11 特殊事例
12 方法注意点
13 质量控制
一批操作的样品中包括至少2个空白样品,1个标准添加组织样品,它们将作为一批分析样品中质量控制的参考样品,同时能决定数据的可靠性,也能评估分析过程中阳性样品的回收率.
14 检测报告
15 缩略语（略）
16 检验流程图
组织样品 1%醋酸乙醇溶液提取 离子交换色谱净化 HPLC 计算结果.