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【转帖】酶标仪性能评价指标与鉴定的基本方法

生命科学仪器综合讨论

  • 觉得不错,不知能否用得上。

    1.方法与原理
    1.1滤光片波长精度检查及其峰值测定
      1.1.1方法及其衡量的标准:用高精度紫外可见分光光度计(波长精度±0.3 nm)对不同波长的滤光片进行光谱扫描,检测值与标定值之差即为滤光片波长精度,其差值越接近于零且峰值越大表示滤光片的质量越好,波长精度越高。
      1.1.2理论基础:酶标仪的滤光片质量好坏,直接影响仪器的灵敏度高低,而滤光片的质量又是以其波长精度及其峰值指标来衡量的,因此滤光片波长精度及峰值是衡量酶标仪的重要参数之一,这在厂家的仪器说明书中虽未曾提及,但在仪器的实际使用过程中,我们发现对滤光片波长精度和峰值进行检查是重要的也是必要的,通过检查可以发现滤光片的波长标定值与实测值的符合程度,可以发现滤光片的质量是否符合要求。
    1.2灵敏度和准确度的监测
      1.2.1方法:①灵敏度:精确配制6 ug/ml重铬酸钾(干燥)溶液(0.05 mo1/L硫酸溶解),加入200 ul重铬酸钾溶液于小孔杯中,以0.05 mo1/L硫酸溶液作空白,于450 nm(参比波长650 nm)测定,其吸光度应≥ 0.01 A。②准确度:准确配制:1mmo/L对硝基苯酚(提纯品)水溶液,然后以10 mmo1/L氢氧化钠溶液25 倍稀释之,加入200 ul稀释液于小孔杯中,以10 mmo1/L NaOH溶液作空白,于405 nm(参比波长650 nm)检测,其吸光度应在0.4 A(0.395~0.408 A)左右。
      1.2.2说明:仪器的灵敏度和准确度主要受两个因素影响:一是滤光片波长的精度,二是检测器的质量。通常情况下,滤光片原因导致仪器的灵敏度和准确度下降比较容易检查;而检测器质量差异则不易被发现,因此我们采用上述两种标准物质溶液对仪器检测器的质量进行定期监测,从而保证了仪器检测结果的可靠性。对于仪器准确性的测定,我们采用了文献报道的方法,经过多次在不同型号仪器间进行反复测定,结果发现该标准物溶液在450nm波长处有一较为恒定的测定值,由于酶标仪与其它分光光度计的光学原理不完全相同,故是否可以作为评价酶标仪准确性的参考方法还有待同行进一步研究考证。
    1.3通道差与孔间差检测
      1.3.1方法及其表达方式:①通道差检测:取一只酶标板小孔杯(杯底须光滑、透明、无划痕、无污染)以酶标板架作载体,分别加入三种不同浓度的甲基橙溶液 200 ul先后置于8个通道的相应位置,蒸馏水调零,采用双波长(测定波长490nm,参比波长630或650nm,以下均相同)连续测三次,观察其不同通道之间测量结果的一致性可用极差值来表示其通道差。②孔间差的测量:选择同一厂家、同一批号酶标板条(8条共96 孔)分别加入200 ul甲基橙溶液(吸光度调至0.065~ 0.070 A)先后置于同一通道,蒸馏水调零,采用双波长检测,其误差大小用±1.96s衡量。
      1.3.2理论解释:为了提高酶标仪的检测速度,根据 96孔酶标板的规格特点,目前大多数厂家的中、高档酶标仪均采用8通道的检测器(部分中、低档酶标仪目前仍采用单通道).因而它们每个通道的检测能力是不尽相同的,它是仪器内部的固有误差,与所测溶液浓度成正相关(不同检测器对不同浓度溶液的响应能力不同),所以通道差是衡量酶标仪性能良好与否的重要指标之一;其衡量指标用极差表示,这与厂家推荐的指标是一致的;极差值越接近于零,通道差越小,说明同一样品于不同通道检测结果的一致性越好。
      由于不同厂家、不同批号酶标板之间的质量差异,导致孔与孔之间的检测结果也不完全一致,这与水平光路光度计的比色皿质量是否符合要求一样,因此我们认为孔间差是仪器外部的固有误差,只有准确测知孔间差,并对结果作出相应的校正,才能使检验结果更符合实际情况、更准确可靠;采用的评价指标(士1.96 s)也是有利于结果校正的。另外,在设计孔间差测量的操作方法上,我们将200 ul甲基橙溶液吸光度调至 0.065~0.070 A,是充分考虑到加样器的误差(上海求精公司,200 ul,士2%CV),其目的是使加样误差控制在仪器的分辨率(0.01 A)以下,这样也就避免了孔间差结果不因加样误差而导致假性增高。
    1.4零点飘移
      1.4.1方法:取八只小孔杯,分别置于八个通道的相应位置,均加入200 ul蒸馏水并调零,采用双波长或单波长(490 nm)每隔30 min测定一次,观察8个通道 4h内的吸光度变化。其与零点的差值即为零点飘移。
      1.4.2测量原理:酶标仪的零点飘移通常是很小的,这是由于仪器在读数之前,先要做8个通道的本底测量(Io).然后再读取样品板的各孔测定值(I),根据 Beer‘s law光吸收值=1ogl0(Io/I),每次读数经过如此的自动校正,使得读数误差大大降低,这样的测读方式无疑是非常正确的的;另外有的仪器是应用"DRL DYE"检测试条来进行绝对吸光度的校准的,因此在采用单波长测量时,会导致吸光度的假性增高,这种仪器可采取两种方法进行校正,一是选择一合适的参比滤光片进行双波长测定,二是引入修正参数,即在吸光度模式下单波长读取1个空白孔,其测试值和预测值之差值即为修正参数。所以零点飘移是评价仪器在一定时间内零点吸光度的变化趋势,与波长无关,它间接地反映了仪器内部检测系统在单位时间内处于工作状态下的稳定性及仪器的机械性能情况(连续进板、检测、退出),故它是评估仪器内部电路系统、光学系统(检测器)及机械系统良好与否的指标。
    1.5精密度评价
      1.5.1方法及评价指标:每个通道三只小杯,分别加入200 ul高、中、低三种不同浓度的甲基橙溶液,蒸馏水调零,采用双波长作双份平行测定,每日测定两次,连续测定20天。分别计算其批内精密度、日内批间精密度、日间精密度和总精密度及相应的CV值。
      1.5.2理论依据:1984年美国临床实验室标准委员会发表了EP5一T文件并于1992年进行了第二次修订:临床化学仪器精密度性能的用户评价。该评价方案在生化分析仪、血细胞计数仪等仪器和试剂的评价中得到了广泛的应用,使评价仪器的方法得到了统一;而该法应用于酶标仪的评价在国内外则尚未见有类似的报道,我们采用该法对酶标仪进行系统评价,结果是比较满意的。各指标的意义为:批内精密度系由20d中每天两批,每批两次之差(即"批内")经统计学处理后所得的结果;日内批间精密度系由20d中每天两批测定结果均值之差(即"批间")经统计学处理后所得的结果;日间精密度表示20 d中每天所测均值的标准差即标准误,反映了每日均值的离散度;总精密度则是对批内、批间和日间精密度进行加权统计的结果。其中以批内精密度和总精密度的应用最为广泛,与传统的批内精密度的计算方法(即对同一标本在同一天内同时重复测定多次)相比,前者更符合实验室的实际情况,更有代表性,也更加合理;而总精密度则客观地全面地反映了实验室的总体变异情况。
    1.6线性测定
      1.6.1方法:精确称取甲基橙配制5个系列浓度的溶液,采用双波长平行检测8次求其均值。计算回归方程、相关系数r及标准估计误差Sy,x,并用±1.96 Sy,x表示样品的95%测量范围。
    1.6.2评价指标解释:线性测定也是评价仪器的重要手段之一,因为它是仪器开展定量工作的基础和前提,某些厂家用标准估计误差s来衡量线性,这与实验室通常所采用的相关系数r是一致的,因此在进行线性评估时,我们同时报告r和Sy,x,目的是为了增强用户与厂家之间的可比性。
    1.7双波长评价
      1.7.1方法:在运用酶标仪检测样品时,由于溶液中的小气泡、杯底的水纹印及划痕、小孔杯之间透明度的差异等等,这些都是仪器测定过程中最常见的干扰因素,而标本中的干扰组份(如溶血、黄道)因洗涤而对测定结果影响则较小,因此我们将文献中的双被长评价方法改为:取同一厂、同一批号酶标板条(每个通道 2条共24孔)每孔加入200 ul甲基橙溶液(吸光度调至0.065~0.070 A)先后于8个通道分别采用单波长(490 nm)和双波长(测定波长490 nm、参比波长630/ 650 nm)进行检测,计算单波长和双波长测定结果的均值、离散度,比较各组之间是否具有统计学差异以考察双波长清除干扰因素的效果。
      1.7.2说明:双波长测定过程中,由于标本中干扰组份的存在以及小孔杯本身质量等原因,常常导致测定结果的假性增高,而酶标仪提供的双波长测定功能则可以消除干扰组份或因素对测定结果的影响.对于标本中干扰组份的清除,在选择参比波长时,我们应对于扰组份的光谱进行研究,以正确选择参比波长;而对于小孔杯本身质量问题等干扰因素的消除,只要选择远离测定波长的参比波长即可以了、这对保证测定结果的准确性是非常重要的。
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  • 雾非雾

    第1楼2008/12/01

    应助达人

    滤光片波长精度检查及其峰值测定
      1方法及其衡量的标准:用高精度紫外可见分光光度计(波长精度±0.3 nm)对不同波长的滤光片进行光谱扫描,检测值与标定值之差即为滤光片波长精度,其差值越接近于零且峰值越大表示滤光片的质量越好,波长精度越高。
      2理论基础:酶标仪的滤光片质量好坏,直接影响仪器的灵敏度高低,而滤光片的质量又是以其波长精度及其峰值指标来衡量的,因此滤光片波长精度及峰值是衡量酶标仪的重要参数之一,这在厂家的仪器说明书中虽未曾提及,但在仪器的实际使用过程中,我们发现对滤光片波长精度和峰值进行检查是重要的也是必要的,通过检查可以发现滤光片的波长标定值与实测值的符合程度,可以发现滤光片的质量是否符合要求。

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  • 雾非雾

    第2楼2008/12/01

    应助达人

    酶标仪选购指南

    首先,酶标仪体积不宜太大。检验室空间有限,仪器体积太大会占据很多空间,给其他工作带来不便。这也是小巧玲珑、外形美观的机型受人青睐的原因。此外,在检验过程中,经常会有样品液体外溅,所以酶标仪外壳要易于消毒、清洁。

    第二,仪器操作要简便,国产的酶标仪,菜单应该用中文来显示。尽管目前检验人员的素质有限大幅度提高,懂英语的人也为数不少,但看中文毕竟比看英文方便、明确。

    第三,可容纳更多的信息。酶标仪比色后的打印记录是最原始的记录之一,如果这份打印记录能显示足够的信息量,将为检验结果的评价提供极大的便利。

    第四,对比色和打印的要求。对于标本量比较大,酶反应终止后,如果不能及时比色,将会影响检测结果。而一台好的酷标仪能够快捷地进行比色和打印,不仅为检测人员节省了大量的时间,而且确保了检验结果的准确性。

    第五,厂商能配置易损部件。酶标仪在临床上使用频率较高,一些部件的损坏率也较高,如放酶标仪的卡夹、滑槽等。厂商能及时地配置易置易损部件,对保证酶标仪正常运行和延长期寿命是非常重要的。

    第六,优质的售后服务。酶标仪需要日常维护和保养,要保证其始终获得准确的检测结果,还应定期进行校正。这要求厂商能提供优质的售后服务,解除用户的后顾之优。

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  • 雾非雾

    第3楼2008/12/01

    应助达人

    酶标仪的自检和校准
    用户所获的酶标仪性能的有关信息资料,基本上可以说是间接的,有了目标以后,如果还想获得对某一酶标仪的感性认识,可以对其进行自检,主要有下述几个方面。
    (一)外观
    酶标仪上应有仪器名称,型号,编号,生产厂家,出厂日期和电源电压;各调节旋钮,按键和开关均能正常工作,外表面无明显机械损伤;显示文字应清楚完整。
    (二)酶标仪的稳定性(漂移)
    选用492nm波长,在吸光度o.0A处,测定标称值为1.0A的光谱中性滤光片(测定操作按仪器说明进行),记录仪器示值或均值,10min后再次记录仪器示值或均值,前后两次测定值之差不应超过±0.005A。
    (三)吸光度测定的准确度
    选用405,492和620 nm波长,以空气为参比,分别测定标称值为0.5和1.0A的光谱中性玻璃滤光片,用专用测试板代替酶标板,按仪器说明连续测定3次,按下式计算准确度:AA=1/3(A、 A。 A3)—A:(A:为标准值)。
    (四)吸光度测定的重复性
    波长选择同(3),在酶标板第一排加注空白溶液,第二排加入浓度为200rig/ml的重铬酸钾溶液,重复测定5次。记录每次测定的第二排吸光度值,取第二排任一孔吸光度值与各次对应孔吸光度值。(五)酶标仪的线性
    选用540nm波长,将标称值o.5,1.0A中性滤光片分别放入专用测试板样本位置中,以空气为参比,各重复测定3次;然后将以上两片中性滤光片叠加后置于专用测试板的同一孔位中,重复测定3次。
    (六)测定速度的检定 .
    选用492nm波长,放人96孔酶标板进行测定,用秒表计测仪器打印出全部数据的时间。
    酶标仪除了在选购时,应尽可能自检外,在使用中也应定期检定,以保证酶标仪测定的有效性。

    附:200rig/ml重铬酸钾溶液的配制
    将重铬酸钾固体试剂放人称量瓶中(去盖)置于烘箱中,在105±5℃下烘2h后,置于干燥器内冷却30min,在分析天平上准确称取o.2829g,置于100ml烧杯中,用o.05mol/L稀硫酸溶解后,移入500ml容量瓶中,以少量o.05mol/L稀硫酸洗烧杯3次,洗液并入容量瓶中,用0.05mol/L稀硫酸稀释至刻度线,摇匀。

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  • 蝴蝶飞飞

    第4楼2010/12/13

    好多年的沉底帖子了,今天有派上了用场,顶起一下

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  • huangza

    第5楼2011/03/15

    应助达人

    继续顶起来!用得上

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  • trytotry

    第6楼2011/03/24

    学习学习,很不错

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