【求助】怎么能让保留时间延长点

用甲醇试过没有？

wertyy 发表:请坛子里的大牛们帮我看下有什么办法可以分离的跟好些？
最近要检测次黄嘌呤肌苷（IMP）又称肌苷酸，是核苷酸的一种。水溶液稳定，呈中性，在酸性溶液中加热易分解。由于这种物质的极性较大用C18柱分离保留时间很短大约是4.7分钟出峰，不能满足在生物样本中的检测要求，因为生物样本中比如血浆的杂质比较多难以清除。
使用的是waters717系列的HPLC C18 4.6×200mm依立特的反向柱（新柱）
流动相是采用20mM磷酸缓冲溶液：乙腈：三乙胺（98.5：1：0.5）
流速为1.1ml/min
柱温：35
用甲醇：水=2:8溶解IMP
进样量：10微L
使用乙腈是因为文献上用了它，柱温，流速也是，而为了修正峰型自己加了三乙胺。
还有就是觉得奇怪进生物样本时，目标峰有所延迟大约5.2分钟出来，但是还是不能和前面的后面的峰分开，最好是在6分多钟出峰。
谢谢大家～～！希望大家群策群力，多多建议～：）

忘了重要的pH是2.5，文献上是这么多，也做过不同pH的考察2.5，3.5，6.5其中还是2.5最好，接下来想看看2.0不知道会不会有所改善。
呵呵～～希望大家能多多讨论，我写得很详细了，自己先顶个～～！

还没有～～，一直在用乙腈～

甲醇的洗脱能力弱，保留时间会延长的

样品极性较大，甲醇的保留时间还不够的话，就需要些键合极性物质的柱子了，你的感觉用甲醇就差不多了吧

多谢～今天就来试下甲醇的情况～～！

可以换根柱子也可以试试，建议用末端健合的柱子，或aq 柱

wertyy 发表:请坛子里的大牛们帮我看下有什么办法可以分离的跟好些？
最近要检测次黄嘌呤肌苷（IMP）又称肌苷酸，是核苷酸的一种。水溶液稳定，呈中性，在酸性溶液中加热易分解。由于这种物质的极性较大用C18柱分离保留时间很短大约是4.7分钟出峰，不能满足在生物样本中的检测要求，因为生物样本中比如血浆的杂质比较多难以清除。
使用的是waters717系列的HPLC C18 4.6×200mm依立特的反向柱（新柱）
流动相是采用20mM磷酸缓冲溶液：乙腈：三乙胺（98.5：1：0.5）
流速为1.1ml/min
柱温：35
用甲醇：水=2:8溶解IMP
进样量：10微L
使用乙腈是因为文献上用了它，柱温，流速也是，而为了修正峰型自己加了三乙胺。
还有就是觉得奇怪进生物样本时，目标峰有所延迟大约5.2分钟出来，但是还是不能和前面的后面的峰分开，最好是在6分多钟出峰。
谢谢大家～～！希望大家群策群力，多多建议～：）

换柱子，你用的柱子，在这个流动相下，也用不了很久的。这个高水相下。最好用亲水的，柱子。可以考虑agilent SB-AQ。亲水，酸性柱。一般国外的柱子由于填料的细度和工艺，会比国产柱子得到较好的分离度，保留时间也有可能延长。

非常感谢大家的帮忙，保留时间的问题已经解决了～～！：）
不过又出现了新的问题～-.-！
现在将条件改成：
20mM磷酸缓冲液：甲醇：三乙胺（V:V:V)=98.9:1:0.1 pH=2.5
现在的目标峰保留时间能调整到8分钟左右了，在标曲中与杂质分离地很好，但是在加入底物孵育的条件后底物峰很大,因为浓度很高了在体系中有1.95mM/L。所以一直造成拖尾严重，基线一直不能下降到0的位置，影响到了目标峰
已经试过的条件有：1 将pH调整到2.3，峰型有所改变但是还是不能分开。
2 调整三乙胺的浓度，0.5完全分不开，0.05没有太大的改善。
3 这个浓度是文献中做过酶动力学实验的，如果降低底物浓度，要求再做酶动力学验证比较复杂，是费力不讨好的事情。


希望大家再次伸出援手呀～～能早日解决这个难题，回家过年！～谢谢～！