【分享】MALDI-TOF-MS

戈壁明珠

2009/02/24

私聊

生物质谱

MALDI-TOF-MS
1. 基本原理
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，其无论是在理论上还是在设计上都是十分简单和高效的。仪器主要由两部分组成：基质附助激光解吸电离离子源（MALDI）和飞行时间质量分析器（TOF）。MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。因此它是一种软电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比，检测离子。MALDI-TOF-MS具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，为生命科学等领域提供了一种强有力的分析测试手段，并正扮演着越来越重要的作用。
有人这样预测:“这个世纪将是TOF和FT的世纪！”
2 分子量测定
分子量是有机化合物最基本的理化性质参数。分子量正确与否往往代表着所测定的有机化合物及生物大分子的结构正确与否。MALDI-TOF是一种软电离技术，不产生或产生较少的碎片离子。它可直接应用于混合物的分析，也可用来检测样品中是否含有杂质及杂质的分子量。分子量也是生物大分子如多肽、蛋白质等鉴定中首要的参数，也是基因工程产品报批的重要数据之一。MALDI-TOF的准确度高达0.1%~0.01%，远远高于目前常规应用的SDS电泳与高效凝胶色谱技术，目前可测定生物大分子的分子量高达600KDa。
3. 蛋白质组学中的质谱技术——肽质量指纹谱技术（PMF）
蛋白质组学是当前生命科学研究的前沿领域。对蛋白质快速、准确的鉴定是蛋白质组学研究中必不可少的关键性的一步。采用MALDI-TOF-MS测得肽质量指纹谱（PMF）在数据库中查询识别的方式鉴定蛋白质，是目前蛋白质组学研究中最普遍应用的最主要的鉴定方法。肽质量指纹谱（Peptide Mass Fingerprinting, PMF）是蛋白质被识别特异酶切位点的蛋白酶水解后得到的肽片段的质量图谱。由于每种蛋白的氨基酸序列（一级结构）都不同，当蛋白被水解后，产生的肽片段序列也各不相同，因此其肽质量指纹图也具有特征性。MALDI-TOF-MS分析肽混合物时，能耐受适量的缓冲剂、盐，而且各个肽片几乎都只产生单电荷离子，因此MALDI-TOF成为进行分析PMF的首选方法。在我们关于蛋白质组学研究的实际工作中，几乎所有的发现均是从这一部开始做起来的！
4. 蛋白质组学中的质谱技术——肽序列标签技术（PST）
由于PMF鉴定结果的可靠性受诸多因素影响，使得部分鉴定结果往往不是十分明确，特异性不高。多肽氨基酸序列匹配被认为是特异性最好的鉴定方法。在蛋白质组学研究中，利用质谱测序一般采用两种方式：一种是利用串联质谱（MS/MS）测序；另一种是利用源后衰变（PSD）技术测序。
在反射式MALDI-TOF-MS中，当脉冲激光照射到微量样品与饱和小分子基质混合形成的共结晶上时，能量通过基质传递给样品，导致样品被解析电离，电离后形成的亚稳分子离子在飞经无场区（即飞行管区）时发生裂解（其活化能来自在离子源与基体发生的碰撞，在无场区与残留气体的碰撞，激光辐射及各种热机制等）所产生的子离子（即源后分解碎片离子），可以通过不断改变反射器电压来进行分离、收集并记录于检测器，形成能为多肽和蛋白质一级结构提供十分丰富而有效的结构信息的PSD质谱图。利用PSD谱图，结合数据库检索可以迅速、高特异性地鉴定蛋白质。
目前，在蛋白质组学研究中，部分经2DE分离的蛋白质样品无法通过PMF鉴定或鉴定结果不明确，可将PSD测序功能应用于这些蛋白质的鉴定。随着对PSD技术的不断研究和发展，尤其是结合MALDI-TOF-MS本身所具有的高灵敏度、高通量、样品靶点可多次应用测定、分析时主要产生单电荷准分子离子以及能够耐受一定量的盐和干扰物等特点，PSD-MALDI-TOF-MS将会在蛋白质组学、代谢组学以及药物筛选的研究中发挥更大的作用。
5. 寡核苷酸的分析
随着分子生物学技术和反义核酸药物技术的发展，越来越多的寡核苷酸片段被合成，用以作引物、探针以及反义药物等。对这些片段进行快速检测，以判断合成的是否完全及合成的序列是否正确，是完全必要的。包括MALDI-TOF-MS在内的生物质谱是迄今为止进行这种检测最好的手段。用MALDI-TOF-MS测定分析寡核苷酸，简单、快速、准确、灵敏。结合3’—外切酶和5’—外切酶可以对寡核苷酸全序列进行测定。

随着人类基因图谱定序完成，逐渐明白基因结构，科学家下一个课题即「基因解码」，便是了解数万个基因所代表的意义和其相互关系，以及蛋白质组功能研究，而结合微电子、微机械、生命科学和生物讯息等的综合产物---「生物芯片」，正是加速解码的工具。生物芯片应用的范围含概了基因功能研究、新药开发、临床检验、菌种筛选、环境控制等等。因此许多人相信，二十一世紀將是生物芯片蓬勃发展的世紀，甚至取代半导体芯片，成为产业新主流。
生物芯片 (Biochip) 技术概念
生物芯片的概念起源于二十世纪80年代后期，广义地说，生物芯片是將生物有关的大分子 (Macromolecules)，如 DNA,Oligonucleotide, Polypeptide, Antibody, 甚至Cell 等，用微面积、高密度之工业技术，精确的点制 (Fabrication) 在如玻璃片或 Nylon膜之固体材料上，制成应用于生物化学分析的产品，其作用对象可以为基因、蛋白质或细胞组织等。生物芯片技术的主要特点是其分析可信度及精确性高、分析速度快，所使用的样品及试剂少，可获得整体性 (平行化) 的实验数据。总体来说，目前生物芯片研究在国际上仍属于初期发展阶段，但已有许多重大成果，如基因芯片 (Genechip, DNAchip or Microarray)、蛋白质芯片 (protein chip)、微流体芯片 (Microfluidics) 及实验室芯片(Lab-on-a-chip)，除了可以做基因表达的分析外，更重要是可以从事 Single nucleotide polymorphism 的鉴定，此对許多遺传疾病的诊断非常有帮助。而 Protein-chip 更可以去探讨蛋白质之间的相互作用、讯息传递的磷酸化反应、及抗原与抗体的结合等，故对細胞生物学有特別重要的意义。其中尤以基因芯片发展较为成熟，目前台湾的研究发展或生技产业所指的生物芯片大都是指基因芯片。

蛋白质芯片 (Protein Chips)

生物体內的基因表现与蛋白质表现并不能画上等号。科学家估计人类的基因约 3～4万个，这些基因经过 RNA 修饰直至蛋白质生成，其可能出现的多样性应该超过 4 万种以上，更加深了研究的复杂性。不过蛋白质芯片如同基因芯片般能提供快速且整体性的分析优势，相信这是提供解決蛋白质组研究的最佳方法之一。若蛋白质芯片能开发成功，进而取代传统的临床检验方法，其所帶来的数百亿商机，是非常惊人的。理论上，蛋白质芯片的制作方法与基因芯片方法相似，差异处只是將作用对象改为蛋白质，亦即玻片上点阵样品和实验样品皆为蛋白质(protein / peptide)。但是在实际的制作与应用却有非常大的困难，因为：

(1)如何维持芯片上蛋白质的生物活性：蛋白质对所处环境要求特別敏感，若不谨慎处理，则容易断裂或变性 (denature)，失去活性。

(2)蛋白质的来源取得不易：能合成有功用的蛋白质技术仍有待解決，且採買价格比DNA 貴数十倍。

(3)芯片与检体间的最佳反应条件(interaction / reaction)：各式各样的蛋白质所需的最佳反应条件不一定相同。

(4)蛋白质芯片载体制作不易：由于蛋白质对物理或化学性质特別敏感，有些种类的蛋白质容易粘附于载体，但某些则相反。因此，载体的选择 (substrate) 与表面处理 (coated slides, blocking....)是一大挑战。

分
该帖子已被版主-jiangkezhi加5积分，加2经验;加分理由:感谢提供资料分享