【原创】超效液相色谱系列专题之一：知识介绍

二、理论基础

随着液相色谱上的发展，也应用了van Deemter曲线及其方程式这个理论。后来出现的Waters公司引入UPLC的概念就是由研究这个著名的方程式开始。 首先探讨一下这个著名的方程式。如果只关心理论塔板高度（H）与流速（线速度；u）及填料颗粒度（dp）之间的关系，就可以把该方程式作如下的简化：

其中，A项代表了颗粒度和柱床填装的优良程度；B项代表了轴向扩散；而C项则代表了传质。从不同颗粒度的曲线中我们可以看到下图所示的现象：

由曲线得知：随着颗粒度减小，相应的理论塔板高度（HETP）也下降，得到的柱效会更高。还应该注意到1.7 μm颗粒的HETP最小值区域扩大了，这表明可以在比大颗粒更宽的流量范围内得到最高的柱效，结果可以不损失高分离度的同时来优化流速（分析速度）。
小颗粒为色谱分离带来如此的高柱效和速度优势，使利用小颗粒技术成为色谱科学家梦寐以求的目标。然而HPLC系统的设计，一直苦于难于发挥出最小颗粒的优点。小颗粒技术的运用，不但要求仪器在超出目前限度（6000 psi/ 400 bar）的压力下工作，同时要求仪器系统体积要更小以便不影响梯度性能，而且还要检测器能高速检测出峰宽只有几秒的色谱峰。首先颗粒度越小柱效越高；其次每个颗粒度尺寸有自己的最佳柱效的流速；最后，更小的颗粒度使最高柱效点向更高流速（线速度）方向移动，而且有更宽的线速度范围。所以降低颗粒度不但提高柱效，同时也提高速度。使用更高的流速会受到色谱柱填料耐压及仪器耐压的限制。反之，如果不用到最佳流速，小颗粒度填料的高柱效就无法体现。另外，更高的柱效需要更小的系统体积（死体积）、更快的检测速度等一系列条件的支持，否则小颗粒度填料的高柱效同样无法充分体现。

三、超效液相色谱仪器的建立

1.要真正创建一个全新的分离科学领域－超效液相色谱仪器，必须解决以下问题：
■ 大幅提高色谱柱的性能；第一要解决小颗粒填料的耐压问题，第二要解决小颗粒填料的装填问题，包括颗粒度的分布以及色谱柱的结构。
■高压溶剂输送单元（超过15000psi）。
■ 完善的系统整体性设计，降低整个系统的体积，特别是死体积。并解决超高压下的耐压及渗漏问题。
■ 快速自动进样器，降低进样的交叉污染。
■ 高速检测器；优化流动池以解决高速检测及扩散问题。
■ 系统控制及数据管理，解决高速数据的采集、仪器的控制问题。

2.仅仅有小颗粒与高速检测器不能构成UPLC
四十年来，Waters以其对液相色谱科学的深入理解和坚实的技术基础，引领着液相色谱技术的不断发展。从六十年代首推世界上第一台液相色谱(LC)系统，到七十年代高效液相色谱(HPLC)技术的商品化，直至2004年超高效液相色谱(UPLC)系统的推出，Waters是色谱技术公认的、当之无愧的领导者。
基于小颗粒技术的UPLC，并非普通HPLC系统改进而成。它不但需要耐压、稳定的小颗粒填料，而且需要耐压的色谱系统(>15,000psi)、最低交叉污染的快速进样器、快速检测器及优化的系统体积等诸多方面的保障，以充分发挥小颗粒技术优势。这就需要对系统所有硬件和软件的进行全面创新。

四、仪器的商品化

Waters公司在2003年首先推出了Acquity UPLC系统，其采用小颗粒填料，在高压下运行。商品化的超高压液相色谱仪器的序幕由此揭开。基于同样原理，Thermo公司和Jasco公司也相继推出了耐压104MPa的液相色谱系统。而Agilent和岛津公司则通过升高温度来降低柱压，尽管同样使用小颗粒填料，但系统压力只有60MPa。下表给出了目前已商品化的超高压液相色谱的性能对照。


下面是几个公司的仪器：

Waters公司Acquity UPLC系统


Agilent 1200快速液相色谱仪


岛津 Prominenece UFLC


Accela高速液相色谱系统(HPLC)（Accela High Speed LC）


Jasco X-treme LC

五、超高压液相色谱泵

Waters公司具备制造超高压泵的能力，除了密封、高压动力之外，超高压色谱泵主要解决的问题是超高压下溶剂的压缩性及绝热升温（Adiabatic Heating）。
ACQUITY UPLC装备一台独立柱塞驱动、四个溶剂切换的两元高压梯度泵，其1ml/min流速时的耐压可达15000psi，具有精确、可靠的梯度性能。新型的超高压输液泵使独特的小颗粒填料技术可以在最优化的流速下工作，以充分发挥其特点。集成改进的真空脱气技术，使四个流动相溶剂及两个进样器洗针溶剂同时得到良好的脱气。其梯度的重现性也非常好，尽管保留时间在1min以内，其重现性却与HPLC的重现性不相上下。

六、超效液相色谱仪器的进样系统

在超高压液相色谱中，进样系统的设计尤为困难。因为它要求进样阀在高压下不仅密封要良好还要有较小的死体积，同时要保证塞型进样，以减小峰展宽。常规商品化的进样阀可以满足小样品塞的要求，但只能承受20-40MPa的压力。目前，在UPLC中使用的进样技术主要包括静态切割、压力平衡、自动进样等几种形式。

七、色谱柱产品

2003年，Waters公司首先推出了亚2um多孔微球填料，采用了1.7um桥接乙烷-硅混合颗粒技术。随后各大色谱公司陆续推出了自己的亚2um填料色谱柱产品，表2给出了商品化的色谱柱。填料是影响液相色谱系统分离能力的关键因素之一。在相同线速度下，填料粒径越小，理论塔板高度越小，柱效越高。小颗粒填料的另一个重要特征是，当增加流量（线性速度）时塔板高度没有明显的增大，且维持在一定范围内，即在较大流量范围内保持较高的柱效。因此，可以通过增加流量来加快分离速度，同时维持较高的柱效和良好的分离效果。

八、超高压引起的相关问题

色谱填料颗粒的大小，色谱柱总孔隙率、死体积、压力梯度，流动相的密度、粘度、扩散系数等。过去被认为是不变的参数也在一定程度上随压力的改变而改变。在只有几十MPa的常规仪器上，这些因素通常可以忽略；但在UPLC中，实验压力往往超过100MPa，通常需要考虑压力对这些参数的影响以及最终对色谱分离的影响。
1. 溶剂的压缩性: ，由于溶剂可压缩，升高压力后导致流量降低，需要根据设定流量与实际流量进行流量补偿
2. 摩擦热效应:流动相以较高速度流过固定相时因摩擦可产生热量，加之流动相和固定相的导热性能较差，可导致温度梯度的出现，造成峰展宽和柱效下降。
3. 安全因素: 在超高压下运行的色谱柱可能发生液体喷射和管壁迸裂。色谱柱裂开或筛板脱离会产生高流速液体喷射，系统中的其他元件如进样阀、冲洗阀、压力传感器和连接管件在高压下长时间使用后脱落也会产生液体喷射。因此，当使用超高压时，必须考虑安全因素。

九、超高效液相色谱的优点

1、超高分离度
色谱工作者正面临分离十分复杂混合物的挑战，如肽的消解产物、杂质及体内代谢物样品等。为了使分离能完全优化就需要一个超高性能的色谱系统。这样一个系统理想地应符合液相柱色谱的基本原理。根据等度液相色谱分离的分离度(Rs)方程，分离度(Rs)与柱效(N)的平方根成正比。

按Van Deemter色谱理论，柱效(N)与颗粒度(dp)成反比：

故：随着dp的降低，N值会增加；而N值增加，则Rs值增加。HPLC与UPLCTM的基本分离理论，进一步说明了颗粒度大小和分离度密不可分的关系。
ACQUITY UPLC系统发挥了1.7μm颗粒提供柱效增高的全部优越性。尤其是1.7 μm颗粒提供的柱效比5 μm颗粒提高了3倍。因为分离度与粒度的平方根成反比，1.7μm颗粒的分离度比5 μm颗粒提高了70％。在梯度分离中也具有同样的优越性，此时分离能力用峰容量衡量。
UPLC用1.7μm颗粒提高了分离能力，可以分离出更多的色谱峰，从而对样品提供的信息达到了一个新的水平。而且又最大地缩短了开发方法所需的时间。


2、超高速度
高通量实验室始终要求在单位时间内提供更多的信息和处理更多的样品并保证提供高质量的数据。较小的颗粒能超乎寻常地提高分析速度而不降低分离度。因为颗粒度减小后，柱长可以按比例缩短而保持柱效不变()，而且Van Deemter理论表明最佳流速与粒度成反比(流量∝1/dp)。柱长缩短会加快分离速度，而颗粒度越小，最佳流速也越大，进而可以通过提高流速来进一步加快分离速度。
由于ACQUITY UPLC系统用1.7 μm颗粒，柱长可以比用5 μm颗粒时缩短3倍而保持柱效不变，而且使分离在高3倍的流速下进行，结果使分离过程快了9倍而分离度保持不变。

UPLC的快速分析亦节省了以往一向耗时的方法认证的时间，使方法认证的变得简单快速。用户不必担心因HPLC转换成UPLC带来的方法认证负担。

原有HPLC分析需要4个不同的方法、三根不同的色谱柱，至少需要65分钟才能完成；UPLCTM使用了一根色谱柱、一种简单方法，在1分钟内即可完成。

3、超高灵敏度
过去几年中，提高灵敏度的工作集中在检测器上，包括光学检测器和质谱检测器。这种趋势主要是受要求检测化合物的浓度越来越低（如高效药物）的驱动。然而采用超高性能色谱系统就能获得灵敏度的显著提高。
在UPLC中始终可得到较高的灵敏度。UPLC使用小颗粒技术可以得到更高的柱效（因而改善了分离度）、更窄的色谱峰宽(N∝1/W²），即更高的灵敏度。
因为色谱峰变得更窄，峰高也就更高了(峰高∝1/W)；同样，当UPLCTM用于快速分析、用较短色谱柱而使柱效不变时，色谱峰高会相应增加 (峰高∝1/L)。因此，使用UPLC技术，不仅可以在在保持与HPLC相同分离度时提高峰高，而且在改善分离度的同时亦可提高峰高即灵敏度。


4、简单方便的方法转换
UPLC与HPLC基于相同的分离机理，故相互之间的方法转换非常容易和方便。现有HPLC方法可以按照比例直接转换成UPLC方法；相反，UPLC方法也很容易可以转换成HPLC方法供常规HPLC系统使用。

十、最佳的质谱入口

Micromass质谱技术与Waters液相色谱技术的强强结合，使UPLC的设计能够充分考虑到质谱检测器的述多特点和需求，成为质谱检测器的最佳液相色谱入口。如此技术与设计上的完美默契，是业界任何仪器供应商难以实现的。UPLC与质谱联用，可以实质性地改善质谱检测结果的质量。UPLC的特殊性能使质谱检测器的性能首次得以充分体现。
由于低流速下色谱峰扩散不大，增加了峰浓度，有利于提高离子源的效率，因而使灵敏度至少提高了3倍。除UPLC技术本身带来的速度、灵敏度和分离度的改善外，UPLCTM的超强分离能力有助于目标化合物与之竞争电离的杂质的分离，从而可以使质谱检测器的灵敏度因离子抑制现象的减弱或克服而得到进一步的提高。故使用UPLC－MS联用，可以获得灵敏度较HPLC－MS联用系统大有改善的分离结果，获得更多、质量更好的信息。