【资料】Sephadex LH20 色谱

2 100g填料已不少了， astra兄的样品如果实在太多，就只好分开上柱了.

3 一般Sephadex LH20上样体积具体也没有明确的规定，在柱床体积的1／10吧。
问：分得效果不是很好，上了有8毫升的样，我用甲醇洗脱，结果用约一个保留体积就洗完了，东西不仅越分越少，而且仍然和没上柱之前差不多，很让人困惑，郁闷。

不要着急,实验是一点一点做出来的,刚开始总是困难的.首先我要说的是Sephadex LH20不是万能的,你的样品不一定适于用它分离,

1 "结果用约一个保留体积就洗完了",这很正常,这也是Sephadex LH20这种填料的特点:"洗脱体积一般为2-3个保留体积，对特殊保留强的化合物，可洗脱5个保留体积",

2 "我用甲醇洗脱,而且仍然和没上柱之前差不多",说明你的样品组分之间分子大小差别不大,所以Sephadex LH20的凝胶过滤作用不起作用了,如果你还用Sephadex LH20分离,那你应该利用他反相分配的作用,即先用低浓度的甲醇/水,逐渐提高甲醇比例,最后才用甲醇洗脱.
1 A君提到用少量的甲醇/水-甲醇洗脱，但洗出的流份比较难处理,是指甲醇水难蒸干吗?其实这根本不应成为问题.astra君请想一想,做植化的,哪有遇不到甲醇水的时候, ODS柱层用甲醇水洗脱, Sephadex LH20柱层用甲醇水洗脱,D101用乙醇水洗脱, HP20 用甲醇水洗脱, 高效液相最常用的是反相, 流动相还是甲醇水,可见甲醇水是植化同志最亲密的朋友! 所以蒸不干也要蒸,想想办法吗!

2 .像水这种高沸点的溶剂是很难蒸干的,,办法是有的,先看看旋转薄膜的几个要素: 真空度, 冷凝液, 蒸发温度.

1) 真空度决定于水泵的效率和系统的密闭性.一般的国产水泵就能满足日常的需要(包括蒸水),但一定注意的是水泵的循环水一定要开,如果不开循环水,水泵中的水很快就会变得很热,将极大地减少水泵的效率,且会将抽出的溶剂挥散出来,很不好! 比国产水泵更好的是进口水泵,比进口水泵更好的是隔膜泵,系统的密闭性就更重要了,特别是蒸像水,丁醇这样的溶剂,对系统的密闭性的要求很高,对于系统密闭性不好时,可采用逐步拆分法来查漏,最容易出问题的地方在垫圈,国产的旋转薄膜配的垫圈很烂,全不耐氯仿等有机溶剂,当用国产的旋转薄膜蒸过氯仿等有机溶剂,垫圈就废了.所以要多预备几个垫圈.

2) 冷凝液一般使用水,如果配一台冷阱,使用半量的水配比上办量的汽车冷冻液, 效果棒极了

3) 提高蒸发温度当然可以提高蒸发的效率,但可能发生物质的变化,国产旋转薄膜,水泵,用水冷,当然就只好提高蒸发温度了

我用东京理化的旋转薄膜,1/2汽车冷冻液冷凝,隔膜泵,蒸水不到45度,很爽!

3 向要蒸的水溶液中加甲醇,使甲醇占到30%,蒸出速度将大大提高!
Sephadex LH20柱子被弄脏了，大多数情况下是由于样品没滤, 将柱头堵住,或由于样品的死吸附(一般很少发生),使柱子的柱头部分污染,一般的处理是将被污染的柱头部分的填料弃去,具体做法很简单,只将被污染的柱头部分的填料用玻棒轻轻搅起,倒掉即可,

2 如果柱子整个被污染,如果是将Sephadex LH20用反相被污染，办法如下
依次用水,NaOH-NaCl水溶液，水，甲醇洗涤被污染的柱子。因为是整个柱子被污染，所以污染物一定不会完全死吸附在柱上（如果完全死吸附在柱上，污染物一定会只在柱头部分），所以用合适的溶剂一定可以将之洗下来。

NaOH-NaCl水溶液配法： 8g NaOH ,30g NaCl， 1000ml水
看了上面战友们的讨论，感觉受益菲浅。小弟也来班门弄斧，发言不对之处，请各位兄台指正：
Sephadex G型葡聚糖凝胶只适合在水中使用，Sephadex G-25羟丙化后就是Sephadex LH-20。此君既有分子筛作用，在由极性与非极性溶剂组成的溶剂中还有反相层析效果。虽然价位很高，但由性能颇佳，可再生利用，所以倍受钦睐。此外上柱样品损失很少，对处理小样品较好，这也是我们实验室常用的原因之一。
我用Sephadex LH-20的步骤是：
1.选择条件：
梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要。首先你的样品须要能溶解在尽量少量的洗脱剂中。极性在的用甲醇水系统;极性小者一般用不含水的系统。我们实验室常用正己烷二氯甲烷甲醇系统，用了很多年，效果较好。
2.饱和层析柱：
用洗脱剂将凝胶摇匀，直立柱身，让其自然沉降，此时要防止气泡留在其中。至少半小时打开开关，流出几个柱体种的洗脱剂，目的是使其膨胀在正确比例的洗脱剂中。
3.样品处理：用尽量少的洗脱剂溶解样品，常压过滤。
4.湿法上柱。这也是要有技巧的步骤。
5.洗脱：控制流速，一般1drop/s以下，可参见厂家的一些参数;必要时更改极性（很多时一个极性就可以将样品洗脱完毕）。
6.再生以备下次使用。
问：不知道用反响柱分离合用LH-20那个效果比较好.同时如果用同一根LH-20的话,洗脱剂可以从氯仿-甲醇换到甲醇-水吗?还有一个问题,上LH-20的时候可以用一个梯度洗脱吧?最后用甲醇冲柱就可以了吧??

1.Sephadex LH-20主要还是分子筛的作用机理，在非极性溶剂中有一定的反相柱效果。如要分离的物质在反相板上分离效果好，那么大可在反相柱中进行分离;如果要分离的物质分子量相差较大，当然是Sephadex LH-20效果好。实际使用中往往上在一起配合使用，逐渐细分为多个部分直到拿到纯品。
2.Sephadex使用时一般不进行梯度洗脱（洗柱的时候当然要换）。如果改变流动相的极性，会改变凝胶的膨胀率，分量不同的物质在网孔改变过程中引起交错，反而达不到分离效果。如果要分离的样品中极性相差较大，可以细分为不同的极性段再上Sephadex LH-20
我们实验室用的LH-20柱一般就是甲醇：二氯甲烷（1：1）作流动相，如果冲不干净就换纯甲醇来冲，没碰到过你说的情况！根据LH-20在不同溶剂中的溶涨程度不同，如果你用的溶剂溶涨系数接近的话，可能影响不大，如果溶剂之间溶涨系数相差较大，我想出现气泡是可能的。（借用前面同学提供的数据）
以下列举了1g干态的,Sephadex LH20对不同溶剂中的保留体积：
water 2.1ml
MeOH 1.9ml
EtOH 1.8ml
CHCl3 1.6ml
n-BuOH 1.6ml
乙酸乙酯 0.4ml
甲苯 0.2ml
丙酮 0.8ml

( 宁波欧普仪器设备有限公司 刘望才博士 )

太感谢了，讲得很仔细，谢谢！！！！

受益匪浅，多谢分享！