pfz1985
第1楼2010/06/17
三是所有细胞荧光都很弱。荧光标记后样品荧光强度低的可能原因有:①所使用的荧光探针浓度过低。②标记条件不适当:孵育的时间、温度不当,大多数情况下都是样品与探针孵育温度太低或时间太短造成。③荧光探针失效。这是一种很常见的标记失败原因。荧光探针一定要低温保存、不要反复冻融、应用液现用现配制,另外其要在保质期内使用。④所用介质、pH值不适当。⑤细胞状态不正常。有一些探针只标记活细胞如果细胞活性不够则难以标记上荧光。⑥探针溶解不充分。⑦探针泄露。如FDA标记细胞后,应在40分钟内测定,否则其从进入开始,120分钟后,其荧光就只剩下约10%,细胞内的荧光探针大部分泄露到细胞外。⑧探针选择错误。⑨荧光干扰。样品中的自发荧光光谱范围很宽,有时会干扰正常细胞染色。⑩荧光重合。除非具备能分开两种光谱相近的仪器设备,应尽量避免两种光谱相近的荧光探针出现在同一样品中,以免引起荧光光谱的重合。⑾观察的荧光条件不适宜。⑿有淬灭剂存在,如果介质中含有淬灭剂,也会使荧光下降或完全淬灭。⒀其他原因:例如,加入试剂种类、顺序错误、漏加试剂及不当的操作均可导致荧光标记失败。在整个实验操作中,还要避免对样品结构造成意外损伤和有关污染影响实验结果。所有荧光标记操作要避光进行,防止光敏效应引起的荧光淬灭或增强等变化。减少的办法是:①控制细胞内探针浓度不要过高;②尽量减少预览及检测时光源照射强度、缩短光照时间、增大检测器的灵敏度;③对于固定样品可用防淬灭剂;④在淬灭严重影响测定的情况下,应考虑换用不易淬灭的探针、改变标记条件或方式。
要防止非特异性标记,正确的设立对照组,防止假阳性和假阴性的出现。荧光标记后,要尽快上机采集图像,防止荧光探针被排出细胞、荧光淬灭及细胞干燥等导致的荧光变化。