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1 引言
近年来，长江、黄河以及珠江中下游的许多湖泊和水库都相继发生了不同程度的蓝藻水华。水华藻类在水面堆集，不但散发鱼腥臭味，而且堵塞管道[1-4]，更严重的是异常增殖藻类释放生物毒素——藻毒素，这些次级代谢产物严重危害了人类的健康和生态安全。目前在蓝藻植物中发现约有30 个水华蓝藻种类是产毒的，主要包括微囊藻、鱼腥藻、束丝藻、节球藻、念珠藻和颤藻等，其中微囊藻在世界各国湖泊、河流中普遍发生水华[5]。微囊藻毒素由于在人体和动物体内具有富集作用，已成为令世人关注的环境卫生问题。从2007年7月1日起，中国实施了新的生活饮用水标准，其中最引入注目的是微囊藻毒素被列入水质检测指标。微囊藻毒素-LR 是目前已知的毒性最强、急性危害最大的一种淡水蓝藻毒素。基于此，我国现执行的生活饮用水水质中藻毒素限值为1.0μg/L[6]。因此，研究灵敏、快速、简单、高效的藻毒素监测技术方法，防范藻毒素给水环境及人类健康带来的威胁，为饮用水安全保障提供技术支撑具有重要的意义。
目前针对微囊藻毒素的检测方法主要有以下几大类[7]：生物毒性测试法、化学测试法、免疫测试法（ELISA）、细胞毒性检测技术、酶活性抑制技术、竞争性结合检测技术等。而HPLC 法则是最为经典和最广泛使用的方法, 它可以对不同类型的MC 进行定性分析和定量检测，检测限一般在ng 以下，准确度和选择性较为突出。
2 材料与方法
2.1 试剂和仪器
安捷伦1200型高效液相色谱仪, Agilent XDB C18 分析色谱柱(4.6 ×150 mm ,5μm)，C18 固相萃取柱(500 mg/6mL), Caliper Auto Trace SPE workstation。
微囊藻毒素标样MC - RR、YR、LR; 甲醇(色谱纯) ; 三氟乙酸(分析纯) ; 超纯水。
2.2 色谱分析条件
流动相采用含0.05% TFA的甲醇水溶液(体积比水:甲醇=40:60)，流速为1ml/min，柱温40℃，检测波长238nm，样品进样量10μL。以保留时间定性，外标法定量。
2.3 样品制备
用SPE富集水样的具体操作是先取500 mL水样，经0.45μm玻璃纤维滤膜减压过滤，使滤液通入已预先活化(用10mL 甲醇、10mL 超纯水各清洗1次)的C18固相萃取(SPE)柱进行富集（控制流速为10 mL/min）。富集完毕，依次用10mL 10%甲醇和10mL 20%甲醇淋洗剂过C18 SPE柱，以淋洗去除杂质。再用10mL含0. 1% TFA的甲醇洗脱，洗脱液用氮吹浓仪定容至1 ml， - 20℃保存待测。
3结果与讨论
3.1 藻毒素富集方法的优化
天然水体中微囊藻毒素的含量通常为ug/L甚至ng/L级，而且环境样品组分复杂，很难进行目标组分的直接检测。当水样中MC-RR、MC-YR和MC-LR浓度小于50 ng/L时，直接用HPLC测试，精度不够，必须进行水样富集预处理。
我们采用全自动大体积液体固相萃取(SPE)仪，与传统的手动萃取方法相比，全自动固相萃取技术显著的优势体现在：①提高样品处理通量，可同时萃取多个样品，大大提高工作效率；②可自动选择不同溶剂进行SPE柱的活化、淋洗、洗脱，减少操作人员在化学气雾中的暴露；③大大减少溶剂的消耗和废物的产生；④回收率高，重现性好；⑤是EPA方法中水样测试认可标准方法；⑥萃取速度一致性好、控制调整方便。
3.2 线性范围和检测限
将MC-LR、MC-RR 和MC-YR 标准品逐级稀释配制成0.1、0.2、0.5、1、1. 5和2 mg/L系列质量浓度，在色谱分析条件下依次测定，以峰面积(Y，mg/L) 对相应的进样量(X ，μV·s) 进行线性回归，回归方程、线性范围及相关系数列于表1。
表1 HPLC测定MC的线性范围及线性方程
藻毒素 | 线性范围（mg/L） | 检测限（ng/L） | 线性方程 | 相关系数(r) |
MC-RR | 0.1～2 | 61 | Y=7.547x+2.279 | 0.9999 |
MC-YR | 0.1～2 | 23 | Y=19.416x+2.233 | 0.9999 |
MC-LR | 0.1～2 | 18 | Y=16.949x+0.01 | 0.9999 |
图1 MC-RR/YR/LR的标准曲线图
3.3 实际水样的测定
通过优化测试条件，建立了SPE - HPLC同时测定水中的3种微囊藻毒素的分析方法，其检出限和回收率可满足实际监测的要求。
3.3.1 太湖原水藻毒素检测
水样取自2009年8月份的太湖水样，用我们优化过的藻毒素检测方法检测出MC浓度见表2。
表2 2009年8月太湖水体中MC含量 (单位：ug/L)
藻毒素 | 1# | 2# | 3# |
MC- RR | 0.88 | 0.95 | 1.8 |
MC-LR | 0.036 | 0.064 | 0.044 |
由于太湖水富营养化严重，藻类大量繁殖，水体已受到微囊藻毒素的污染，MC-RR的浓度较高，1#和2#都已接近1 ug/L，3#更高达1.8 ug/L，MC-LR的浓度普遍较低，都在100 ng/L以下。需注意的是“水华”暴发期间，水体中的微囊藻毒素浓度较低，但随着藻细胞的死亡，水体中的微囊藻毒素浓度随之增大，并且胞内藻毒素- LR的含量也会明显升高，因此“水华”暴发后受微囊藻毒素污染的水体对人体健康的危害更大，应加强水源地水体中微囊藻毒素浓度的监测，确保饮用水的安全。
3.3.2 上海某水源水库原水藻毒素检测
2009年8月，在上海某水源水库原水（水库A）的进水处和出水处采集水样进行藻毒素检测。由图3可以看出，水库A中未检测出MC-LR和MC-YR这两种微囊藻毒素，且在进水处的MC-RR也仅为108 ng/L左右。原因可能是由于微囊藻毒素一般是由蓝藻释放产生的，而水库A中的藻类以绿藻为主，蓝藻数目相对较低，所以藻毒素浓度很低。
图2 水库（A）原水藻毒素检测HPLC色谱图
4结论
本研究对藻毒素的监测过程中遇到的一些问题进行了探讨，并提出了优化措施，应用优化后的前处理和SPE-HPLC检测方法同时测定分析不同水源原水的3种微囊藻毒素（MC-RR、YR、LR），取得较为理想的分析效果，其检出限和回收率可满足实际监测的要求。
1)水样中胞外微囊藻毒素测定的前处理优化流程：水样经微孔滤膜过滤，滤液过C18柱， 经10%甲醇+ 20%甲醇方案梯度淋洗，用0.1% TFA-甲醇进行洗脱， 洗脱收集液用浓缩仪定容至1mL。
2) HPLC 进样分析时，选用甲醇和0.05% TFA水溶液作为流动相进行等梯度洗脱，对于MC-RR、MC-YR和MC-LR有较好的分离效果，且保留时间适中，同时又可以尽可能地避免杂质干扰。
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